Name: salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs
Uploaded: 2016-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
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We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

I Medaka giapponesi utilizzati in questo studio sono stati trattati umanamente secondo le linee guida istituzionali di Toyo University, con la dovuta considerazione per l&#39;alleviamento della sofferenza e disagio. 1. argento Nanocolloids (SNCS) <ol><li> Acquisto SNCS purificati (20 mg / L -1, 99,99% di purezza, di particelle di diametro circa 28,4 ± 8,5 nm sospeso in acqua distillata significa). </li><li> Convalida la purezza e la concentrazione dell&#39;argento da accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma (ICP-MS) analisi in base alle istruzioni per l&#39;uso 8. Il metodo di pretrattamento per ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 2. Preparazione del SNC Solutions (miscele di argento colloidi e Ag +) con diverse salinità <ol><li> Preparare 60 ERM × costituito da 60 g di NaCl, 1,8 g KCl, 2,4 g di CaCl 2 · 2H 2 O, e 9,78 g MgSO 4 · 7H 2 O in 1 L di ultacqua rapure; regolare il pH a 7,0 con 1,25% NaHCO 3 in acqua ultrapura. </li><li> Agitare la soluzione ERM a 25 ° C per una notte. </li><li> Mescolare SNCS con ERM diluito. Preparare 40 ml di ciascuna soluzione mista SNC-ERM. La concentrazione finale è di 10 mg / L -1 di SNCS in diverse concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o). </li><li> Regolare il pH della soluzione mista SNC-ERM a 7,0 con 0,625% NaHCO 3 in acqua ultrapura. la regolazione del pH è molto importante nella preparazione della soluzione SNC, perché Ag + rilascio è facilitato da condizioni acide 9. </li><li> Utilizzare AgNO 3 come composto di riferimento per SNCS. <ol><li> Mescolare AgNO 3 con ERM diluito. Preparare 40 ml di Agno 3 -ERM soluzione mista ad un AgNO 3 concentrazione di 15,7 mg / L -1 (10 mg / L -1 argento) a differenti concentrazioni di ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, 30x o) . Nota: Per esaminare la tossicità colloidi d&#39;argento, Agno 3soluzione, che è una fonte di argento solubile, viene usato come composto di riferimento per SNCS, che sono una miscela di colloidi di argento e argento solubile. </li></ol></li></ol> 3. Medaka cultura e la raccolta Egg <ol><li> Ottenere il Medaka (latipes O.) (ceppo arancio-rosso) (60 maschi e 60 femmine). </li><li> Cultura Medaka come gruppi (20 maschi e 20 femmine come un unico gruppo) in 1x ERM in 3 serbatoi L utilizzando un sistema di coltura Medaka flow-through. <ol><li> Cultura alle seguenti condizioni: intervallo di pH del mezzo di coltura: 6,2 e 6,5 luce: buio ciclo: 16: 8 ore temperatura del mezzo di coltura: 24 ± 0.5 ° C pressione osmotica del mezzo di coltura: 257 mOsm </li></ol></li><li> Alimentare Medaka su Artemia salina naupli alle 10:00 (una volta al giorno) ed alimentare una dieta pesce secco artificiali alle 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 e 17:00 (cinque volte al giorno). <ol><li> Ottenere A. salina nauplii. </li> &lt;li&gt; Preparare 5 L di una soluzione salina 3,0% in un beaker di plastica. </li><li> Aggiungere 30 g di uova del gambero di salamoia per la soluzione salina nel bicchiere. </li><li> Incubare le uova a 25 ° C per 48 ore con gorgogliamento (4 L / min -1) utilizzando una pompa di aerazione. </li><li> Dopo 48 ore, arrestare il bubbling. </li><li> Lasciare che la soluzione riposare per 5 a 10 minuti per separare la A. tratteggiato salina nauplii (parte inferiore della soluzione) dalle uova non schiuse e gusci d&#39;uovo (parte superiore della soluzione). </li><li> Rimuovere lo strato superiore della soluzione per decantazione. </li><li> Filtrare la porzione inferiore della soluzione attraverso un setaccio con aperture di 283 micron, e raccogliere i naupli che passano attraverso una rete con aperture di 198 micron. </li><li> Alimentare il nauplii alle Medaka entro 6 ore. </li></ol></li><li> Dopo i Medaka femminili hanno generato, rimuovere gli ammassi di uova esterni delicatamente dai corpi delle femmine o raccogliere le uova dal fondo della vasca di pesci utilizzando un smtutti i net (dimensione netta 5 cm x 5 cm, dimensione del foro 0,2 mm x 0,2 mm). </li><li> Risciacquare il cluster uovo con acqua corrente per 5 sec. </li><li> Aggiungere tutti i cluster di uova sciacquati a 30x soluzione ERM. </li><li> Rimuovere i cluster dalla soluzione dopo 1 min e posizionare i grappoli d&#39;uovo tra gli asciugamani di carta a secco e ruotare delicatamente. </li><li> Mettere le uova di nuovo nel ERM 30x. </li><li> Selezionare uova fecondate sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Luogo scelto 810 uova in 1x ERM in sei pozzetti di plastica utilizzando una pinza. </li><li> Incubare le uova a 25 ± 0,1 ° C in un incubatore fino stadio di sviluppo 21. (Stadi di sviluppo degli embrioni Medaka sono stati definiti dal lavoro di Iwamatsu 10). </li><li> Scegliere uova incubate in fase di sviluppo 21 sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Risciacquare uova selezionati con 1x ERM. </li><li> Sottoporre le uova sciacquati agli esperimenti di esposizione (sezione 4). </li></ol> 4. Prove di tossicità dei SNCS o AgNO 3 </sub&gt; A differenti salinità ERM <ol><li> Risciacquare uova Medaka (fase 21) tre volte con soluzione di prova [SNCS (10 mg / L -1) o AgNO 3 (15,7 mg / L -1 a 10 mg / L -1 argento) a ciascuna concentrazione di ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x, 30x o) a pH 7]. Come controlli, utilizzare uova in 1 × 30 × ERM a pH 7. </li><li> Aggiungere 15 uova sciacquati a 5 ml di ciascuna soluzione di prova in sei pozzetti di plastica. (Eseguire gli esperimenti di esposizione tre volte per il SNC o AgNO 3 di tossicità test con ogni soluzione di prova.) </li><li> Avvolgere le piastre in alluminio. </li><li> Incubare le piastre avvolte a 25 ° C al buio fino alla schiusa o per 14 giorni. </li><li> Osservare le uova esposte ogni 24 ore per i cambiamenti biologici e uova morti (figure 1 e 2). </li><li> Sostituire le soluzioni in esame ogni 24 ore. </li><li> Eseguire osservazioni come segue. <ol><li> Il giorno 6 di esposizione, contare la frequenza cardiaca (per 15 sec) oembrioni Medaka f sotto un microscopio da dissezione utilizzando un cronometro (Figura 3a). </li><li> Il giorno 6 di esposizione, si misura la dimensione dell&#39;occhio (diametro) di embrioni Medaka sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3b). </li><li> Il giorno schiusa, misurare le lunghezze corpo pieno di larve sotto un microscopio da dissezione utilizzando un micrometro (Figura 3c). </li><li> Contare il numero totale di uova che si schiudono esposti nei 14 giorni (figura 3d). </li></ol></li></ol> 5. L&#39;isolamento di Silver solubile da SNC Solution, e analisi d&#39;argento <ol><li> Isolare argento solubile di ciascuna soluzione SNC (una miscela di colloidi di argento e argento solubile) filtrando attraverso un filtro a membrana 3 kDa a 14.000 x ge 4 ° C per 10 min. Utilizzare un filtro a membrana 3 kDa per isolare l&#39;argento solubile dalle SNCS, perché il diametro medio riportato SNCS aggregati in 1x ERM è 67,8 nm 11 aND quella di Ag + è 0,162 nm 12; la membrana 3 kDa esclude le particelle con un diametro di 2 nm o più 13. </li><li> Misurare la concentrazione di argento in 50 ml di soluzione filtrata (= concentrazione argento solubile) mediante ICP-MS analisi (figura 3e) secondo il manuale operativo ICP-MS 8. Il metodo di pretrattamento per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 6. Misure di Silver bioaccumulo in Medaka Embrioni <ol><li> Esporre uova Medaka (fase 21) a SNCS o AgNO 3 come descritto nella sezione 4. </li><li> Il giorno 6 di esposizione, rimuovere corion dall&#39;uovo (vale a dire, dechorion) utilizzando Medaka cova enzima secondo il protocollo descritto nel Libro Medaka 14. </li><li> Misurare la concentrazione d&#39;argento delle uova dechorioned mediante analisi ICP-MS secondo la ICP-MS manuale operativo 8 (Figura 3f). Il pretrattamentometodo per la ICP-MS analisi è descritto nel capitolo 7. </li></ol> 7. misurazione della concentrazione d&#39;argento per ICP-MS Analysis <ol><li> Aggiungere esempi [50 ml di soluzione d&#39;argento (per la validazione della concentrazione di argento, sezione 1); tre embrioni dechorionated (sezione 5); o 50 ml di soluzione filtrata (sezione 5)] per un 50 ml di Teflon bicchiere. </li><li> Aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro al bicchiere da 50 ml. </li><li> Scaldare la miscela su un piatto caldo a 110 ° C fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore). </li><li> Per sciogliere la sostanza organica completamente, aggiungere 2,0 ml di acido nitrico ultrapuro e 0,5 ml di acqua ossigenata nel becher. </li><li> Scaldare la miscela di nuovo sulla piastra calda fino a poco prima che si asciughi (circa 3 ore). </li><li> Sciogliere il residuo in 4 ml di soluzione di acido nitrico ultrapuro 1,0%. </li><li> Trasferimento 4 ml di soluzione in una provetta da centrifuga. </li><li> Ripetere 7.6 al 7.7 volte (per un totale di tre volte). Il volume finale è 12.0ml. </li><li> Misurare la concentrazione d&#39;argento del campione (sciolto in acido nitrico ultrapuro 1,0%) utilizzando analisi ICP-MS secondo il manuale operativo 8. <ol><li> Utilizzare un interno e una soluzione standard esterno (vedi elenco dei materiali) per quantificare la concentrazione di argento. La soluzione standard interna ed esterna è accreditato dalla American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Limiti di rilevazione d&#39;argento erano 0,0018 ng / ml -1 (soluzione) e 0.016 ng mg-peso -1 (corpo dell&#39;embrione). </li></ol></li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Coastal Condition Report. , (2001).</li><li>Sakaizumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inorganic+salts+on+mercury-compound+toxicity+to+the+embryos+of+the+Medaka,+Oryzias+latipes.">Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes.</a> J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).</li><li>Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+(Oryzias+latipes)+Embryo+toxicity+of+treated+leachate+from+waste-landfill+sites.">Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites.</a> J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).</li><li>Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Nanoparticles+in+the+See-through+Medaka+(Oryzias+latipes).">Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes).</a> EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , (2006).</li><li>Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+salinity+on+the+development+of+chloride+cells+of+freshwater+and+brackish-water+medaka,+Oryzias+latipes.">Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes.</a> Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , (2007).</li><li>Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanocolloids+disrupt+medaka+embryogenesis+through+vital+gene+expressions.">Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions.</a> ES &amp; T. 46 (11), 6278-6287 (2012).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).</li><li>Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salinity+increases+the+toxicity+of+silver+nanocolloids+to+Japanese+medaka+embryos.">Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos.</a> Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).</li><li>Shannon, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+effective+ionic+radii+and+systematic+studies+of+interatomic+distances+in+halides+and+chalcogenides.">Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides.</a> Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).</li><li>Wakamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Medaka è un pesce d&#39;acqua dolce che è altamente tolleranti all&#39;acqua di mare; non è ben noto che l&#39;habitat naturale originali pesce era acqua salata largo della costa giapponese 6. Quindi, pesce Medaka sono ben sviluppate cellule cloruro 7. Questa struttura unica fornisce agli scienziati un nuovo modo per testare la tossicità delle sostanze chimiche nell&#39;ambiente in funzione della salinità (acqua dolce ad acqua di mare) utilizzando solo una singola specie di pesce. <p class...

Dal momento che l&#39;istituzione dell&#39;Organizzazione per la Cooperazione Economica e linee direttrici per lo sviluppo (OCSE) per le sostanze chimiche di test nel 1979, 38 linee direttrici sono state pubblicate nella sezione 2 delle linee guida, gli effetti sulla biotici Sistemi 1. Tutti gli organismi acquatici sottoposti alla prova sono stati da habitat d&#39;acqua dolce, vale a dire le piante d&#39;acqua dolce; alghe; invertebrati come dafnie e chironomidi; e pesci, come Medaka, zebrafish, e la trota arcobaleno. Rispetto agli ambienti di acqua salata, ambienti d&#39;acqua dolce sono più direttamente interessate da attività economiche e industriali umani. Pertanto, ambienti d&#39;acqua dolce sono state priorità per il test, perché sono a più alto rischio di inquinamento. Nelle zone costiere, tra cui estuari, salinità variano tra condizioni di acqua e acqua di mare salmastra, e queste zone sono spesso inquinate da attività industriale 2. Le zone costiere e le loro zone umide associati sono caratterizzati da hIGH biodiversità ecologica e produttività. Gli ecosistemi costieri devono pertanto essere protetti da inquinamento chimico. Tuttavia, vi è stata limitata la ricerca ecotossicologiche in acqua e acqua di mare salmastra habitat. Sakaizumi 3 studiato le interazioni tossiche tra metil mercurio e la salinità nelle uova Medaka giapponesi e ha scoperto che aumentando la pressione osmotica della soluzione di prova migliorato la tossicità del mercurio metilico. . Sumitani et al 4 utilizzati uova Medaka per studiare la tossicità del percolato di discarica; hanno scoperto che l&#39;equivalenza osmotica del percolato alle uova è stata la chiave per indurre anomalie durante l&#39;embriogenesi. Inoltre, Kashiwada 5 ha riferito che le nanoparticelle di plastica (39,4 nm di diametro) facilmente permeato attraverso il corion Medaka uovo in condizioni salmastre (15x embrione allevamento medio (ERM)). Un tipico modello di piccoli pesci, i Medaka giapponesi (Oryzias latipes </em&gt;) è stato usato in biologia di base e ecotossicologia 6. Medaka giapponesi possono vivere in condizioni che vanno da acqua dolce ad acqua di mare a causa delle loro cellule cloruro altamente sviluppati 7. Sono quindi suscettibili di essere utile per testare in condizioni con una vasta gamma di salinità.

<table><tbody><tr><td>Silver nanocolloids</td><td>Utopia Silver Supplements</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31319-45</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28513-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06730-15</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>21002-85</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31212-25</td><td>For making ERM</td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31018-72</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>HORIBA, Ltd.</td><td>F-51S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler-Toledo International Inc.</td><td>MS204S</td><td></td></tr><tr><td>medaka (&lt;em&gt;Oryzias latipes&lt;/em&gt;) orange-red strain</td><td>National Institute for Environmental Studies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medaka flow-through culturing system</td><td>Meito Suien Co.</td><td>MEITOsystem</td><td></td></tr><tr><td>Artemia salina nauplii eggs</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>4975677033759</td><td></td></tr><tr><td>aeration pump</td><td>Japan pet design Co. Ltd</td><td>non-noise w300</td><td></td></tr><tr><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Marubeni Nissin Feed Co. Ltd</td><td>Otohime larval &amp;beta;-1</td><td>Artificial dry fish diet</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>Fujikogaku, Ltd.</td><td>10450023</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Nksystem</td><td>TG-180-5LB</td><td></td></tr><tr><td>shaker</td><td>ELMI Ltd.</td><td>Aizkraukles 21-136</td><td></td></tr><tr><td>6-well plastic plates</td><td>Greiner CELLSTAR</td><td>M8562-100EA</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>AS ONE Co.</td><td>6-713-02</td><td></td></tr><tr><td>stopwatch</td><td>DRETEC Co. Ltd.</td><td>SW-111YE</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa membrane filter</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>0.5 ml centrifugal-type filter</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Teflon beaker</td><td>AS ONE Co.</td><td>33431097</td><td></td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-538</td><td>For internal standard</td></tr><tr><td>Custom claritas standard</td><td>SPEXertificate</td><td>ZSTC-622</td><td>For external standard</td></tr><tr><td>ultrapure nitric acid</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>28163-5B</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide&amp;nbsp;</td><td>Kanto Chemical Co.</td><td>18084-1B</td><td>for atomic absorption spectrometry</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermo Scientific X Series 2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hot plate</td><td>Tiger Co.</td><td>CRC-A300</td><td></td></tr></tbody></table>

salinity-dependent toxicity assay of silver nanocolloids using medaka eggs

Salinità è una caratteristica importante per l&#39;ambiente acquatico. Per gli organismi acquatici definisce gli habitat di acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Prove di tossicità delle sostanze chimiche e valutazioni delle loro rischi ecologici per gli organismi acquatici vengono spesso eseguite in acqua dolce, ma la tossicità delle sostanze chimiche per gli organismi acquatici dipende dal pH, temperatura e salinità. Non esiste un metodo, tuttavia, per testare la dipendenza salinità di tossicità per gli organismi acquatici. Qui, abbiamo usato Medaka (Oryzias latipes) perché possono adattarsi a acqua dolce, acqua salmastra e acqua di mare. Diverse concentrazioni di media embrione-allevamento (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x e 30x) sono stati impiegati per testare la tossicità delle particelle nanocolloidale argento (SNCS) per Medaka uova (1x ERM e 30x ERM avere pressioni osmotiche equivalente rispettivamente acqua dolce e acqua di mare,). In piastre sei pozzetti di plastica, 15 uova Medaka in triplice copia, sono stati esposti a SNCS a 10 mg / L &amp;# 8722; 1 in diverse concentrazioni di ERM a pH 7 e 25 ° C al buio. Abbiamo usato un microscopio da dissezione e un micrometro per misurare la frequenza cardiaca per 15 secondi e l&#39;occhio di diametro il giorno 6 e piena lunghezza del corpo delle larve sul schiusa giorno (sezione 4). Gli embrioni sono stati osservati fino alla schiusa o il giorno 14; Abbiamo poi contato il tasso di schiusa ogni giorno per 14 giorni (sezione 4). Per vedere l&#39;accumulo d&#39;argento negli embrioni, abbiamo usato ad accoppiamento induttivo spettrometria di massa a plasma per misurare la concentrazione d&#39;argento di soluzioni di test (sezione 5) ed embrioni dechorionated (sezione 6) .Il tossicità dei SNCS di embrioni Medaka ovviamente aumentata con l&#39;aumento della salinità. Questo nuovo metodo ci permette di testare la tossicità delle sostanze chimiche in diverse salinità.

L&#39;effetto della salinità sulla tossicità SNC era molto evidente: l&#39;induzione di deformità o morte era salinità dipendenti (figure 1 e 2). Abbiamo misurato biomarcatori fenotipiche (frequenza cardiaca, dimensioni degli occhi, la lunghezza di tutto il corpo, e tasso di schiusa) nel SNC (10 mg / L -1) embrioni -exposed. Questi biomarcatori fenotipiche hanno rivelato tossicità SNC salinità-dipendente. <p class="jove_content" fo:k...

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Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Developmental Biology

7.9K Views.  Toyo University. Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

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Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Metodo ecotossicologico con i batteri marini<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Per valutare la tossicità acuta dei contaminanti ambientali

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

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Ambiente

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Biologia dello sviluppo

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong antimicrobial effects. They also may be released into the environment and accumulate in the ocean. Therefore, AgNPs are the major source of Ag contamination, and public awareness of the environmental toxicity of Ag is increasing. Previous studies have demonstrated the bioaccumulation (in producers) and magnification (in consumers/predators) of Ag. Cetaceans, as the apex predators of ocean, may have been negatively affected by the Ag/Ag compounds. Although the concentrations of Ag/Ag compounds in cetacean tissues can be measured by inductively coupled plasma mass spectroscopy (ICP-MS), the use of ICP-MS is limited by its high capital cost and the requirement for tissue storage/preparation. Therefore, an autometallography (AMG) method with an image quantitative analysis by using formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue may be an adjuvant method to localize Ag distribution at the suborgan level and estimate the Ag concentration in cetacean tissues. The AMG positive signals are mainly brown to black granules of various sizes in the cytoplasm of proximal renal tubular epithelium, hepatocytes, and Kupffer cells. Occasionally, some amorphous golden yellow to brown AMG positive signals are noted in the lumen and basement membrane of some proximal renal tubules. The assay for estimating the Ag concentration is named the Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), which is a regression model established by the data from image quantitative analysis of the AMG method and ICP-MS. The use of AMG with CHAA to localize and semi-quantify heavy metals provides a convenient methodology for spatio-temporal and cross-species studies.

A protocol is presented to localize Ag in cetacean liver and kidney tissues by autometallography. Furthermore, a new assay, named the cetacean histological Ag assay (CHAA) is developed to estimate the Ag concentrations in those tissues.

Uso di Autometallography per localizzare e semi-quantificare argento nei tessuti dei cetacei

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal toxicity test is frequently used in regulatory risk assessment of chemicals. In order to achieve high reliability and reproducibility the development of standardized guidelines is vital. For algal toxicity testing, the guidelines require stable and uniform conditions of parameters such as pH, temperature, carbon dioxide levels and light intensity. Nanomaterials and other so-called difficult substances can interfere with light causing a large variation in results obtained hampering their regulatory acceptance. To address these challenges, we have developed LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). The setup utilizes LED illumination from below allowing for a homogenous light distribution and temperature control while also minimizing intra-sample shading. The setup optimizes the sample volume for biomass quantification and does at the same time ensure a sufficient influx of CO2 to support exponential growth of the algae. Additionally, the material of the test containers can be tailored to minimize adsorption and volatilization. When testing colored substances or particle suspensions, the use of LED lights also allows for increasing the light intensity without additional heat generation. The compact design and minimal equipment requirements increase the possibilities for implementation of the LEVITATT in a wide range of laboratories. While compliant with standardized ISO and OECD guidelines for algal toxicity testing, LEVITATT also showed a lower inter-sample variability for two reference substances (3,5-Dicholorophenol and K2Cr2O7) and three nanomaterials (ZnO, CeO2, and BaSO4) compared to Erlenmeyer flasks and microtiter plates.

We demonstrate algal toxicity testing for difficult substances (e.g., colored substances or nanomaterials) using a setup illuminated vertically with an LED.

Un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

Chimica

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Biologia

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicina

Batteria di test comportamentali per valutare gli effetti neurotossici nel pesce zebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autore in primo piano: Valutazione dei cambiamenti comportamentali ambientali e indotti da farmaci nel pesce zebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Tossicità Assay salinità-dipendente di Silver Nanocolloids Utilizzando Medaka uova

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metodo ecotossicologico con i batteri marini

Il trattamento di droga e

Uso di Autometallography per localizzare e semi-quantificare argento nei tessuti dei cetacei

Un'installazione su piccola scala per il test della tossicità delle alghe di nanomateriali e altre sostanze difficili

Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio