Name: lateral root inducible system in arabidopsis and maize
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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The authors thank Davy Opdenacker for technical assistance and photography. We greatly thank Dr. Annick Bleys for helpful suggestions to improve the manuscript. This work was financed by the Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' from the Belgian Federal Science Policy Office, by the FWO grant G027313N and by the Agency for Innovation by Science and Technology, IWT (IR).

1. Arabidopsis LRIS Protocol Hinweis: Der Text bezieht sich auf &quot;klein&quot; oder &quot;groß&quot; angelegten Experimenten. Kleinen Maßstab Versuche, wie Markierungslinie Analyse und histologischen Färbung 6, 14, erfordern nur ein paar Proben. Großversuche, wie die quantitative Echtzeit-qRT-PCR, Mikroarrays 9-11 oder RNA-Sequenzierung, erfordern eine größere Menge von Proben. Als solche wird eine Menge von etwa 1000 Sämlinge pro Probe wurde durch Vanneste et al. 11 verwendet, um Mikroarray nach Wurzelsegment Dissektion durchführen. TAG 1 <ol><li> Sterilisation von Arabidopsis-Samen Hinweis: Wählen Sie eine der folgenden Verfahren für die Saatgut Sterilisation. Einer von ihnen ist geeignet für die nächsten Schritte des Protokolls. Gassterilisation (1.1.2) stellt zwei Hauptvorteile gegenüber Flüssigkeitssterilisation (1.1.1): Es dauert weniger Zeit beim Umgang mit einer großen tauber von Saatgut, weil kein Pipettieren muss für die einzelnen Proben auftreten; und die sterilisierten Samen können für einen längeren Zeitraum gelagert werden. Es erfordert jedoch einen Exsikkator und sorgfältige Handhabung. <ol><li> Flüssigkeitssterilisation <ol><li> Gießen Sie die gewünschte Anzahl von Samen in Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie bis zu 20 mg (~ 800 Samen) in einem 1,5-ml-Röhrchen oder 40 mg (~ 1600 Samen) in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1 ml 70% Ethanol. Invertieren oder schütteln für 2 min. </li><li> Ersetzen Sie die 70% Ethanol mit 1 ml Sterilisationslösung für 15 min. (Bereiten Sie frische Sterilisationslösung: 3,85 ml Natriumhypochlorit (NaOCl) stock (12%) (ACHTUNG: Dunstabzug), 5 ul Tween 20, bis zu 10 ml mit Wasser Kehren Sie die Röhrchen mehrere Male, um sicherzustellen, dass alle Samen zu kommen. in Kontakt mit der Lösung. </li><li> In einem laminaren Luftstrom Schrank, ersetzen Sie die Sterilisationslösung mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser und spülen Sie die Samen 5 mal für 5 Minuten durch wiederholtely Austausch mit 1 ml frischem sterilem destilliertem Wasser. </li></ol></li><li> Gassterilisation <ol><li> Gießen der gewünschten Anzahl von Samen in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einzelne Rohre bei der Arbeit mit mehreren unabhängigen Linien, und ordnen sie in einem Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen Box oder Halter eröffnet. Wenn die Anzahl von Samen in einem Rohr 500 übersteigt (12,5 mg), unterteilen die Samen in die entsprechende Anzahl von Rohren zur erfolgreichen Sterilisation zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, die Kappen der Nachbarrohre einander nicht decken. Zusammenpassen, die Deckel der Kiste auf dem Boden, wie es braucht, um im Exsikkator als auch für die Sterilisation ist. </li><li> Legen Sie die Box in der Schüssel mit einem Exsikkator, zusammen mit einem Becherglas (ACHTUNG: Dunstabzug). </li><li> Füllen Sie das Becherglas mit 100 ml von 12% NaOCl (ACHTUNG: Abzugshaube). Setzen Sie den Deckel auf dem Exsikkator, aber lassen Sie eine kleine Öffnung, wo das Becherglas platziert. </li><li> 3 ml 37% ige Salzsäure (rauchende) (CAUTION: Verwendung Dunstabzug) in das Becherglas durch die kleine Öffnung und der Exsikkator schnell zu schließen. Die Lösung perlt seit einiger Zeit aufgrund von Cl 2 -Gas-Formation. Lassen Sie das System geschlossen O / N (oder zumindest 8 h). </li><li> Entfernen Sie den Deckel des Exsikkator. Nehmen Sie die Box und bedecken Sie es mit dem Deckel, um eine Verunreinigung während des Transports zu vermeiden. </li><li> Legen Sie die Box in einem laminaren Luftstrom Kabinett, entfernen Sie den Deckel und lassen Sie die Samen für etwa 1 h bei RT, um Gas-Release zu ermöglichen. Hinweis: Seeds sicher trocken in geschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 ° C gelagert werden bis zu 2 Wochen. </li></ol></li></ol></li><li> Laterale Wurzelinduktion in Arabidopsis <ol><li> Seitenwurzel Inhibition (NPA-Behandlung) <ol><li> Vorzubereiten Wachstumsmedium für in-vitro-Wachstum. Das Medium von halber Stärke Murashige und Skoog Salzgemisch 15, 0,1 g / l Myo-Inositol, 10 g / l Saccharose enthält und mit 0,5 gepuffertg / L 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES). </li><li> Passen Sie mit 1 M KOH den pH-Wert auf 5,7. Hinzufügen von 8 g / l von Pflanzengewebe Agar und autoklaviert das Medium für 20 Minuten bei 121 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung von NPA in Dimethylsulfoxid (DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). In laminarem Luftstrom kühlt man das autoklavierte Medium auf etwa 65 ° C (das ist die Temperatur, bei welcher die Flasche mit der Hand gehalten werden soll), und geben 25 mM NPA-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 10 uM NPA erhalten. </li><li> Homogenisierung nach Zugabe durch leichtes Schütteln der Flasche für 10 Sekunden. Gießen Sie 50 ml Medium pro Quadratpetrischale (12 cm x 12 cm). Hinweis: Bei der Großversuch, tragen Sie eine Nylon-Mesh (20 um), um einfache Übertragung zu gewährleisten. Vorbereitung einer Masche (9 cm x 9 cm) zum Autoklavieren (Figur 1A). Wenn autoklaviert das Armierungsgewebe in das Wachstumsmedium mit sterilen Pinzetten (1B). Schieben Sie die Masche in das Wachstumsmedium mit einem sterilized drigalsky sicherstellen, dass es in gutem Kontakt mit dem Wachstumsmedium (1B) ist (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen). </li><li> Die Saat auf den NPA-Platten. Hinweis: Bei einem Großversuch ist geplant, säen 2 dicht und gut ausgerichteten Reihen mit 50 Samen, um die Probenahme zu erleichtern (siehe 1.2.2.3). <ol><li> Im Falle von flüssigen Sterilisation, die Saat auf NPA-Platten mit einer 200 ul-Pipette. Abgeschnitten 3-4 mm von dem Ende der Pipettenspitzen in sterilen Bedingungen (oder vor der Sterilisation der Spitzen), um in der Lage, um die Samen pipettieren sein. Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um erneut zu suspendieren die Saat, so pipettieren etwa 150 &amp; mgr; l sterilem Wasser mit 10 - 20 Samen und warten, bis der Samen Sediment am Boden der Spitze. (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen) Hinweis: Beim Berühren der Agar oder die Maschen sanft mit der Spitze, wird ein Wassertropfen mit einem Startkapital von ihm (1C) freigegeben werden. </li> &lt;li&gt; Im Falle der Gassterilisation, die Saat mit autoklaviert toothpicks.Pinch den Zahnstocher in den Agar, bevor die Samen, um eine klebrige Oberfläche zu gewährleisten. Nehmen Sie den Samen einer nach dem anderen mit dem Zahnstocher und verteilen die Samen auf den Platten (1D). Alternativ fügen sterilem Wasser auf den Samen, und säen, wie in 1.2.1.5.1 beschrieben (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen). </li></ol></li><li> Verschließen Sie die Platten mit atmungs Klebeband und speichern sie Platten bei 4 ° C im Dunkeln für mindestens 2 Tage und höchstens eine Woche. Dies ist für die Schichtung und stellt sicher, synchronisiert und effizienter Keimung erforderlich. Anmerkung: Alternativ können Samen vor der Aussaat geschichtet, in destilliertem Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen, die weniger Kühlraum benötigt getaucht. In diesem Fall speichern Sie die Röhrchen für mindestens eine Woche bei 4 ° C, und bewegen Sie die Platten auf die Wachstumskammer unmittelbar nach der Aussaat (siehe 1.2.1.7). TAG 3 </li&gt; <li> Bewegen die Platten an der Wachstumskammer (Dauerlicht (110 &amp; mgr; E m -2 s -1), 21 ° C) für 5 Tage (2 Tage der Keimung und 3 Tagen Wachstum) in einer fast vertikalen Position (80 bis 90 °) Wurzelwachstum auf, und nicht in dem Medium zu gewährleisten. TAG 8 </li></ol></li><li> Laterale Wurzelinduktion (NAA Treatment) <ol><li> Bereiten Sie die gleichen Wachstumsmediums, wie in 1.2.1.1 und 1.2.1.2 beschrieben. Bereiten Sie eine 50 mM Stammlösung von NAA in DMSO (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). Kühlen Sie das autoklavierte Medium auf 65 ° C und fügen NAA Lösung für das Medium, um eine Endkonzentration von 10 &amp; mgr; M zu erhalten NAA (ACHTUNG: Arbeiten unter sterilen Bedingungen). <ol><li> Homogenisierung nach Zugabe durch leichtes Schütteln der Flasche für 10 Sekunden. Gießen Sie 50 ml Medium pro Quadratpetrischale (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Sämlinge aus den Platten, die Wachstumsmedium mit 10 &amp; mgr; M NPA ergänzt um jene supgänzt mit 10 uM NAA. <ol><li> Haken Sie die Arme des gebogenen Pinzette unter den Keimblättern des Keimlings und nehmen Sie es vorsichtig von der Platte. Nur übertragen Sämlinge von denen die Wurzeln vollständig in Kontakt mit der NPA-Wachstumsmedium und vorzugsweise nach unten gewachsen. </li><li> Überfliegen die Wurzel über die NAA-enthaltenden Wachstumsmedium Oberfläche über eine kleine Distanz. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzenwurzeln sind in gutem Kontakt mit dem Wachstumsmedium. Falls erforderlich, drücken Sie die Wurzel vorsichtig in das Wachstumsmedium Fläche mit der Pinzette. Hinweis: Bei einem Großexperiment, entfernen Sie alle Sämlinge, die in Kontakt mit dem Netz und Übertragung durch Anheben des Mesh an den beiden oberen Ecken mit einer Pinzette nicht. Sicherzustellen, dass die Maschen in guten Kontakt mit dem NAA haltigen Medium durch Abschöpfen des Netzes über die Agaroberfläche über einen kleinen Abstand (1E). </li></ol></li><li> Verschließen Sie die neuen Platten mit atmungsBand und legen Sie sie in der Wachstumskammer (conDauerlicht (110 &amp; mgr; E m -2 s -1), 21 ° C) in einer vertikalen Position für die gewünschte Zeit nach der Induktion bis zur Probenahme. Hinweis: Bei einem Großexperiment, mit einem Skalpell, um die Wurzelsegmente auf einmal direkt auf dem Netz geschnitten und probieren Sie sie durch sanftes Abkratzen der Oberfläche des Netzes. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. LRIS Maize Protocol <ol><li> Schichtung der Maiskörner <ol><li> Maiskörner Inkubieren bei 4 ° C im Dunkeln für mindestens 1 Woche. Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit dem B73 Maisinzuchtlinie entwickelt. </li></ol></li><li> Sterilisation von Maiskörnern TAG 1 Anmerkung: Obwohl Maissämlinge müssen nicht unter sterilen Bedingungen gezüchtet werden, wird empfohlen, um die Maiskörner zu sterilisieren und mit Sterilgutes von Pilzwachstum in der Papierrolle zu verhindern,System. <ol><li> Legen Sie die erforderliche Anzahl von Maiskörnern in einem sterilisierten Glasbecher. </li><li> 100 ml Sterilisationslösung (6% NaOCl in Wasser) (ACHTUNG: Abzugshaube). </li><li> Fügen Sie einen Magnetrührstab und das Becherglas auf einem Magnetrührer bei niedriger Rührgeschwindigkeit (ca. 250 UpM) bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Fünfmal für 5 min gründlich durch Ersetzen der Lösung mit 100 ml frischem sterilem Wasser. </li></ol></li><li> Aussaat Maiskörner <ol><li> Setzen Sie auf Handschuhe, um das Risiko einer Kontamination zu verringern, und nehmen Sie eine Rolle Papiertücher. </li><li> Reißen Sie zwei Strecken der Handtuchpapier mit einer Gesamtlänge von zwei Blätter (ungefähr 92 cm x 24 cm), und legen Sie sie auf der jeweils anderen auf einer sauberen Oberfläche (2A). </li><li> Falten Sie die Blätter zu verdoppeln über die Länge (ungefähr 92 cm x 12 cm) (2A). </li><li> Verwenden einer Pinzette zu 10 Kerne in etwa 2 cm von der Spitze über t verteilener gesamten Länge des Papiers, ohne dabei einen Zwischenraum von 8 cm zwischen jedem Kernel und 8 cm an beiden Enden frei (2B). Sicherstellen, dass die Keimwurzel des Kernels nach unten und in Richtung des Papiers (2B). </li><li> Sanft rollen Sie das Papier über die Länge, während die Samen an Ort und Stelle (2B). Um den Roll zu erleichtern, ist es optional, ersten sprühen Sie das Papier mit sterilem Wasser. </li><li> Setzen Sie die Papierrollen in sterilisierte Glasröhren von ca. 6 cm Durchmesser und 14 cm Höhe (zB 250 ml Zentrifugenröhrchen) und legen Sie sie in einem Rack (2C). </li></ol></li><li> Laterale Wurzelinduktion in Mais <ol><li> Bereiten Sie eine 50 mM NPA-Stammlösung (gelöst in DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). </li><li> Für jedes Rohr, einen 50 uM NPA Lösung durch Zugabe von 125 ul von 50 mM NPA Stammlösung zu 125 ml sterilem Wasser in einem sterilisierten Glasbecher. </li><li> Gut mischen undPour 125 ml der 50 uM NPA-Lösung über der Papierrolle in das Rohr. Die Papierrolle wird die Lösung absorbieren und völlig durchnässt. Hinweis: Bei Verwendung von Papierrollen und Rohre mit anderen Dimensionen, die Lautstärke entsprechend an. Die Flüssigkeit sollte auf halber Strecke das Rohr zu erreichen, um eine ausreichende Aufnahme zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die Papierrollensystem in einer Wachstumskammer für drei Tage (27 ° C, Dauerlicht, 70% relative Luftfeuchtigkeit). Stellen Sie sicher, dass die Papierrollen bleiben Hinzufügen von zusätzlichen 50 uM NPA-Lösung eingeweicht, da die Lösung im Laufe der Zeit (2D) verdampft. TAG 4 </li><li> Bereiten Sie eine 50 mM NAA-Stammlösung (gelöst in DMSO) (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). </li><li> Für jedes Rohr, bereiten eine 50 uM NAA Lösung durch Zugabe von 125 &amp; mgr; l aus der 50 mM NAA Lager zu 125 ml sterilem Wasser in einem sterilisierten Glasbecher. </li><li> Sanft Großteil der verbleibenden NPA-Lösung von den Papierrollen und legen Sie diem in sterilem Wasser für 5 Minuten, um es zu waschen (ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe). Sanft das meiste Wasser aus der Papierrollen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. </li><li> Gut mischen und gießen Sie die 50 uM NAA-Lösung über die Papierrollen in den Rohren. Sicherstellen, dass sie völlig durchnässt werden. </li><li> Legen Sie die Papierrollensystem in der Wachstumskammer (27 ° C, Dauerlicht, 70% relative Feuchtigkeit) nach der Induktion der gewünschten Dauer. </li></ol></li><li> Laterale Wurzelinduktion in Zufälliges Crown Wurzeln von Mais Hinweis: Die LRIS wie oben beschrieben induziert Seitenwurzeln in der Primärwurzel. Doch in Mais und anderen Monokotyledonen, der primären Wurzel und den embryonalen Samen Wurzeln, zusammen mit ihren Seitenwurzeln, sind während der Keimlingsentwicklung vor allem wichtig. Zu einem späteren Zeitpunkt in das Pflanzenwachstum ergeben sich die post-embryonale Adventivwurzeln auf dem Stamm und zu entwickeln Seitenwurzeln, eine neue Wurzelsystem 16 bilden auch. Die LRIS kann auch nützlich seind, um Seitenwurzeln auf diesen post-embryonale zufällige Krone Wurzeln, indem Sie einige kleinere Anpassungen an der LRIS auf der embryonalen Primärwurzel zu induzieren. <ol><li> Um die Papierrollen zu machen, erstellen Sie ein Sandwich von Papieren mit jeweils zwei Schichten aus Handtuchpapier auf der Außenseite und zwei Lagen Papier Keimung innerhalb. Legen Sie die sterilisiert Kernel (siehe Schritte 2,1 bis 2,2) in zwischen den beiden Platten der Keimung Papier. Keimung Papier, verglichen mit Handtuch Papier, wird weniger anfällig für durch die Wurzelhaare und Seitenwurzeln, die machen die Öffnung der Papierrollen später leichter durchdrungen werden können. Auf der anderen Seite werden die beiden äußeren Schichten Handtuchpapier Absorption der Flüssigkeit zu erleichtern. </li><li> Legen Sie die Brötchen in 700 ml Glasröhrchen und gießen sterilem Wasser ohne NPA über sie. Sicherstellen, dass sie völlig durchnässt werden. </li><li> Keimen die sterilisierten Kerne in der Wachstumskammer (siehe Schritt 2.4.9). </li><li> Wachsen die Setzlinge bis die zufällige Kronenwurzelnbeginnen zu entstehen (6 Tage B73). Sicherstellen, dass die Papierrollen werden nass zu jeder Zeit durch Zugabe von sterilem Wasser, wenn nötig gehalten wird. </li><li> Transfer in ein 25 &amp; mgr; M NPA-Lösung für 4 Tage (siehe Schritte 2.4.1 bis 2.4.4), gefolgt von einem ähnlichen Induktion Seitenwurzel Initiierung durch Ersetzen der NPA-Lösung mit einer 50 &amp; mgr; M NAA Lösung nach einem Waschschritt (siehe Schritt 2.4 0,5 bis 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings.">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li><li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethylene+on+uptake,+distribution,+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C.">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li><li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2,4-dichlorophenoxy+acetic+acid,+naphthalene-1-acetic+acid,+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells.">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li><li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgenomics:+genome-scale,+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers.">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li><li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor.">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Im Arabidopsis LRIS Protokoll ist es wichtig, nur die Keimlinge, die vollständig in Kontakt mit der NPA-enthaltenden Wachstumsmedium gezüchtet wurden übertragen. Dies stellt sicher, daß Seitenwurzelinitiierung über den gesamten Wurzellänge blockiert. Um Verwundung der Pflänzchen bei der Übertragung zu verhindern, können die Arme der Pinzette unter gekrümmte den Kotyledonen der Sämling eingehängt werden. Bei der Übertragung, stellen Sie sicher, dass die Sämling Wurzeln sind in ausreichenden Kontakt...

Das Wurzelsystem ist von entscheidender Bedeutung für das Pflanzenwachstum, da es sicherstellt, Verankerung und die Aufnahme von Wasser und Nährstoffen aus dem Boden. Weil die Expansion eines Wurzelsystem stützt sich hauptsächlich auf die Herstellung von Seitenwurzeln, ihre Einführung und Bildung weitgehend untersucht worden. Seitenwurzeln in einer bestimmten Untergruppe von Perizykel Zellen initiiert, die so genannte Gründerzellen 1. In den meisten Dikotyledonen wie Arabidopsis thaliana, sind diese Zellen an den Protoxylem Polen 2 angeordnet, wohingegen in Monokotyledonen wie Mais, werden sie an den Phloem Pole 3 gefunden. Gründer-Zellen werden durch eine erhöhte Auxin Reaktion 4 markiert, gefolgt von der Expression spezifischer Zellzyklusgene (zB CYCLIN B1; 1 / CYCB1; 1), wonach sie eine erste Serie von asymmetrischen anticlinal Divisionen 5 unterzogen werden. Nach einer Reihe von koordinierten Antiklinale und perikline Divisionen wird ein Seitenwurzel Primordium ausgebildet ist, dass schließlich wird als ein hervorutonomous Seitenwurzeln. Der Ort und Zeitpunkt des Seitenwurzel Initiation sind jedoch nicht vorhersehbar, da diese Ereignisse weder reichlich, noch synchronisiert. Dies erschwert die Verwendung von molekularen Ansätzen wie Transkriptomik, um diesen Prozess zu studieren. Um dies zu bewältigen, wurde ein Seitenwurzel induzierbare System (LRIS) entwickelt worden, 6, 7. In diesem System werden die Sämlinge zuerst mit N-1-Naphthylphthalamidsäure (NPA), der Auxin-Transport und die Akkumulation hemmt folglich blockiert Seitenwurzelinitiations behandelten 8. Durch anschließendes Überführen der Keimling zum Medium, das die synthetischen Auxin 1-Naphthalin Essigsäure (NAA), reagiert die gesamte Perizykel Schicht auf den erhöhten Auxin Ebenen dadurch massiv Induktionsseitenwurzel Einleitung Zellteilungen 6. Als solche führt dieses System, um schnelle, synchrone und umfangreiche Seitenwurzeln Einweihungen, was eine einfache Sammlung von Wurzelproben für eine bestimmte Stufe der späten angereichertral Wurzelentwicklung. Anschließend kann diese Proben verwendet werden, um genomweite Expressionsprofile während der seitlichen Wurzelbildung zu bestimmen. Die LRIS hat bereits bedeutende Wissen über Seitenwurzel Einleitung in Arabidopsis und Mais 9-13, aber die Notwendigkeit ergab, dieses System auf andere Pflanzenarten gelten wird noch deutlicher, da mehr Genome sequenziert werden, und es gibt ein wachsendes Interesse an Wissen, um wirtschaftliche Bedeutung zu übertragen Spezies. Hier werden die detaillierten Protokolle des Arabidopsis und Mais LRISs angegeben. Als nächstes wird ein Beispiel für die Verwendung des Systems vorgesehen ist, die darstellt, wie Transkriptomik Daten aus dem Mais LRIS gewonnen kann verwendet werden, um funktionelle Homologe, die eine konservierte Funktion während der seitlichen Wurzel Einleitung in verschiedenen Pflanzenarten zu identifizieren. Schließlich Richtlinien, um die LRIS Optimierung für andere Pflanzenarten vorgeschlagen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ARABIDOPSIS LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gas sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glass desiccator</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifuge tubes box or holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%</td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Making a mesh for transfer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetic nylon mesh 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square petri dish plates</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN tubes</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml centrifuge tubes</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cut pipette tips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving</td></tr><tr><td>breathable tape&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth room</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C, continuous light</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MAIZE LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maize kernels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of kernels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M (maize primary root), 25 &amp;micro;M (maize adventitious root)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M (maize)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paper hand towels</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) tubes</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml tubes</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylinders, round foot tube, D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>for maize tubes, home made</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth cabinet</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C, continuous light, 70% relative humidity</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible system in arabidopsis and maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Anwendung des LRIS um des Seitenwurzel Initiation Prozess durchzuführen Vergleichs Transcriptomics Eine Anwendung der LRIS ist der Vergleich und die Korrelation von Genexpressionsprofilen in seitlichen Wurzelbildung in verschiedenen Arten. Vergleichende Transkriptomik nähert schaffen die Möglichkeit, orthologen Genen in der lateralen Wurzelentwicklung in verschiedenen Spezies beteiligt lokalisieren. Seitenw...

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Seitenwurzelinduzierbares System bei Arabidopsis und Mais | Biologie | Video

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Seitenwurzel induzierbaren Systems in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Und Mais

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

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Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

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Serie: Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Forschung

Biochemie

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Genetik

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

Lignin Herunterregulierung<em&gt; Zea mays</em&gt; Über dsRNAi und Klason Lignin Analyse

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Biotechnik

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Umwelt

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Entwicklungsbiologie

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Biologie

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium- Vermitteltune unreife Embryo-Transformation von widerspenstigen Mais Inzuchtlinien mit morphogenen Genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-vermittelte Induktion und Regeneration behaarter Wurzeln bei Pflanzen

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Autor im Rampenlicht: Optimierung von haarwurzelbasierten Transformationsprotokollen für eine höhere Effizienz bei Brassicaceae

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Seitenwurzel induzierbaren Systems in

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