D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

In dieser Studie wurden erwachsene (6-8 Wochen) weiblichen C57BL / 6-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden nach den Richtlinien der Ghent University Vivarium gehalten und gezüchtet. Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt. 1. Herstellung von mononuklearen Zellen (MNC) aus Maus-Milz <ol><li> Opfern Sie die Maus durch Genickbruch. </li><li> Platzieren Sie die Maus wieder auf den Seziertisch Platte und befestigen Sie die hinteren und Vorderbeine mit Stiften. </li><li> Sterilisieren der Haut-Oberfläche mit 70% (vol / vol) Ethanol / H 2 O. </li><li> Schneiden Sie die Haut an der Bauchmittellinie, um den Brustkorb und setzen die Milz mit sterilen chirurgischen Instrumenten. </li><li> Nach dem Trimmen die umliegenden Fettgewebe, legen Sie die Milz in eine 24 Well-Platte mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT. </li><li> Präparieren Sie die Milz mit einem sterilen Skalpell und übertragen Sie die Stücke in eine 70 &amp; mgr; m Nylon-Filter in einem 50 ml Wanne platzierte. </li><li> Unter Verwendung eines 2 ml Spritzenkolben vorsichtig zerdrücken die Milz Stücke durch die Zelle Sieb und Waschen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> 3 ml Ficoll-Paque in ein 15 ml-Röhrchen und überlagern das Dichtegradientenmedium mit 5 ml Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 20 min bei RT ohne Bremse. </li><li> Übertragen Sie die Interphase in ein frisches 15-ml-Tube, 10 ml kaltem 1x PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 2 ml 1x PBS, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (FACS-Puffer). Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen mit 10 ul 0,4% mischen </li></ol> 2. Anreicherung zur Erkennung und Reinigung von Maus iNKT Cells <ol><li> Bereicherung der Maus Milz CD5positive (CD5 +) Lymphozyten. <ol><li> (Optional) Flecken 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen)für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln, Waschen mit 200 ul FACS-Puffer und resuspendieren in 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer. Vorbereitung einer 20 &amp; mgr; M Arbeitslösung von 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS wird mit 1 &amp; mgr; l davon auf 10 5 Zellen in FACS-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben Sie 10 4 pre-angereicherten Zellen am Durchflusszytometer. <ol><li> Verwendung von FCS-H und FCS-W, elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (1A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + (toten) Zellen innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (1B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch wählen Sie die Lymphozytenpopulation nach Größe (1C). </li><li> Verwendung von Zellen in der Lymphocyten-Schranke, plotten SSC-A gegenüber CD5 und elektronisch Gate CD5 + Lymphozyten, wie in Figur 1D gezeigt. Erwerben den Rest der Pre-angereicherten Probe auf dem Durchflusszytometer. </li&gt; </ol></li><li> Passen Zellzahlen bis 10 7 Zellen pro 90 &amp; mgr; l in FACS-Puffer und fügen Sie 10 ul anti-CD5 Mikroperlen. </li><li> Inkubation bei 4 ° C für 15 Minuten, einmal mit 4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 500 ul kaltem FACS-Puffer waschen. Bereichern Sie für CD5 + Lymphozyten unter Verwendung von Magnetzellseparation (MACS) Spalten nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Optional) Stain 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen) und DAPI, wie in 2.1.1. Erwerben Sie 10 4 angereicherten Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer und überprüfen, ob die elektronischen Tore in 2.1.1 erstellt. Wählen CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Zellfraktion. Erwerben Sie 10 5 Zellen am Durchflusszytometer und analysieren die Prozent CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Fraktion vorhanden, wie in 1E gezeigt - H. </li></ol></li><li> Nachweis und zur Isolierung von Maus iNKT cells durch FACS. <ol><li> Resuspendieren angereichert CD5 + Lymphozyten in einer Konzentration von ca. 10 6 Zellen pro 20 ul in FACS-Puffer, enthaltend anti-CD16 / CD32 (4 &amp; mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und PE-konjugiertem αGalCer / CD1d Tetramer (1 ug / 10 6 Zellen). </li><li> Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Verdünnte Maus-Antikörpern (mAbs) gegen CD3 &amp; egr; V500 (4 &amp; mgr; l 1:20 Verdünnung / 10 6 Zellen), Anti-CD19-E450 (4 &amp; mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und Anti-CD8a E450 (4 ul Verdünnung 1:50 / 10 6 Zellen) in FACS-Puffer, CD5 + Lymphozyten hinzuzufügen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 4 ml FACS-Puffer bei einer Endkonzentration von 10 7 Zellen / ml. </li><li> Filtern Sie die Zellen durch ein 30 &amp; mgr; m Zellsieb und legen Sie die Zellen auf Eis. </li><li> Kalibrierung des Durchflusszytometers Zellsortierung nach den Empfehlungen des Herstellers 14,15. Hinweis: Kalibrierung von einem Durchflusszytometer für Zellsortierung erfordert Training und kann von einem erfahrenen Bediener oder einen ausgebildeten Techniker durchgeführt werden. </li><li> Zugabe von 10 ul einer 20 uM Lösung von Arbeits DAPI pro 10 6 Zellen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben etwa 10 4 angereichert CD5 + Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer. Elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (2A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + CD8 + CD19 + Zellen (Dump-Kanal) innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (2B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch zu wählen Lymphozyten (2C), wie in 2.1.1.1 beschrieben, . <ol><li> Plot αGalCer / CD1d Tetramer von CD3 &amp; egr; und elektronisch Gate αGalCer / CD1dTetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen, wie in 2D gezeigt. Erwerben nicht mehr als 2 x 10 5 CD5 + Lymphozyten angereichert, um den Prozentsatz zu bestimmen αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen in der angereicherten Zellfraktion vorhanden ist. </li></ol></li><li> Verwendung der elektronischen Tore in 2.2.7 erstellt., FACS sortiert αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen am Durchflusszytometer bei 70 psi unter Verwendung eines 70 &amp; mgr; m Düse bei einer Flussrate von &quot;1,5&quot;. Sammeln sortierten iNKT Zellen in einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. Anschließend Spülen sortiert iNKT Zellen von der Seite der FACS-Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Medium und Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren sortiert iNKT Zellen in 1 ml RPMI 1640-Medium und 40 &amp; mgr; l davon zu erwerben mit einem Durchflusszytometer, um die Reinheit der sortierten iNKT Zellen beurteilen. Wählen FSC-W lo DAPI - Lymphozytens wie in 2.2.7 beschrieben. (2E - G) und elektronisch Gate αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen, wie in Figur 2H gezeigt ist. </li></ol></li></ol> 3. Kultur und Ausbau der Maus iNKT Cells Tag 0 <ol><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 &amp; egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung für 1 h bei RT. Wasche zweimal mit 200 ul 1x PBS und einmal mit 200 ul vollständigem RPMI 1640-Medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5,5 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol). </li><li> Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen nach iNKT (Schritt 2.2.8) unter Verwendung von 0,4% einer Zählkammer nach 1.11., Bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, die rekombinantes murines IL-2 (10 ng / ml), rekombinantem murinem IL-12 (1 ng / ml) und löslichen Anti-Maus-CD28 (5 &amp; mgr; g / ml). Platte sorted iNKT Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 &amp; egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage. </li></ol> Tag 2 <ol start="3"><li> Übertragen Sie die Zellen in ein frisches unbeschichteten Flachboden-96-Well-Platte und die Kultur der Zellen unter Ruhebedingungen in vollständigem RPMI-1640-Medium bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage. </li></ol> Tag 4 <ol start="4"><li> Verdrängen die Zellen von der Platte durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 300 g 10 min bei 4 ° C, resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium mit rekombinantem murinem IL-7 (5 ng / ml), und die Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in einer Flach Boden 96-Well-Platte für 4 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. </li></ol> Tag 8 <ol start="5"><li> Sammeln der Zellen in ein frisches Röhrchen, Zentrifuge bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliche anti-CD28 (5 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 &amp; egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung und waschen wie in 3.1. Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 &amp; egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator bis Tag 11. </li></ol> Tag 11-18 <ol start="7"><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,4 bis 3,6. </li></ol> Tag 19-20 <ol start="8"><li> Übertragen der Zellen in ein frisches 15-ml-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in vollständigem RPMI-1640-Medium. </li><li> Platten Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Platte und damit die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator vor dem Einsatz in einem Experiment zu verwenden ruhen. </li></ol> 4. Zytokinproduktion durch Maus iNKT Zellen unter Verwendung eines CD1d Plate-gebundenen Assay <ol><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit 100 &amp; mgr; l an rekombinantem murinem CD1d (10 ug / ml in 1x PBS) pro Well und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Mit 200 ul 1x PBS waschen viermal mit 200 ul 2% FCS in 1x PBS (Blocklösung) pro Vertiefung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Blockierlösung, fügen Sie 200 ul αGalCer (5 ng / &amp; mgr; l) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. [Zur Herstellung des αGalCer Lösung werden 1,085 μ 1x PBS auf 55 &amp; mgr; g αGalCer in Vehikel, das 96 mg / ml Saccharose, 10 mg / ml Natriumdesoxycholat und 5 mg / ml Tween 20 gelöst]. </li><li> Nach der Inkubation, entsorgen Sie die αGalCer Lösung und waschen Sie das auch mal mit 200 ul 1x PBS, gefolgt von 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium. </li><li> Sammeln die in vitro expandiert iNKT Zellen am Tag 21, Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in komplettem RPMI-1640-Medium in einer Konzentration von 0,5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Fügen Sie 200 ul der Zell iNKT Resuspension pro Well und Inkubation für 72 h bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit und messen Zytokine von Interesse durch Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol>

<ol>
	<li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells:+development,+specificity,+and+function.">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li><li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells.">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families.">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells.">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li><li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1-restricted+CD4++T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice.">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li><li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides.">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li><li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease:+a+joint+dilemma.">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity:+a+new+immunoregulatory+axis.">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li><li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity.">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li><li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids.">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li><li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1.">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li><li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection,+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells.">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li><li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li><li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+'real+time'.">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li><li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages.">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Kritische Schritte in der aktuellen Protokoll gehören die Isolierung und anschließende Anreicherung von CD5 + Lymphozyten (Abschnitt 1 &amp; 2), FACS-Sortierung (Abschnitt 3) und die anfängliche Plattierung iNKT Zellen (Abschnitt 4). Der Schritte in Abschnitt 1 durchgeführt wird, denken Sie daran, vorsichtig Schicht die Milz-Zellsuspension über das Dichtegradienten-Medium, so dass eine deutliche zelluläre Interphase wird nach der Zentrifugation generiert. Die anschließende Bereicherung für CD5 +<...

Murine invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zellen sind eine deutliche Bevölkerung von angeborenen T-Lymphozyten im Thymus durch CD1d-exprimierenden kortikalen Thymozyten 1,2 ausgewählt. iNKT Zellen einen T-Zellrezeptor (TCR) von einer invarianten Vα14-Jα18 TCR-Kette gepaart mit entweder Vβ8, Vβ7 oder Vβ2 TCRs 3, die in der Lage ist Erkennung von endogenem sowie fremde Lipidantigene im Kontext von CD1d ist besteht. B. murine iNKT Zellen erkennen und werden durch eine endogene Lipid Antigen genannt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, sowie α-Galactosylceramid (αGalCer) 5,6, einem Glykolipid aus marinen Schwämmen isoliert aktiviert. TCR-abhängige Aktivierung von iNKT Zellen fördert die Grundierung von der adaptiven Immunantwort, und als ein Ergebnis haben iNKT Zellen gezeigt wurde in der Linderung oder Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich rheumatischen Erkrankungen und Krebs 7 funktionell beteiligt werden &lt;sup&gt; 8. Derzeit synthetischen iNKT Zellliganden bilden vielversprechende neue Impfstoff-Adjuvantien, die in der Lage, die Regulierung eine Reihe von immunpathologischen Bedingungen sein kann. Es ist zuvor gezeigt worden, daß iNKT Zellen können in vitro nach der Isolierung aus Mausgewebe jedoch erzeugt werden; viele dieser Untersuchungen beschäftigen die Verwendung von primären Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und / oder Zelllinien 9, Vα14 TCR transgenen (Tg) Mäuse 10 oder thymomas zur Erzeugung iNKT Zellen abgeleiteten Hybridome 11,12. Darüber hinaus eine große Anzahl von Mäusen, stellen große Mengen an Reagenzien, wie αGalCer belasteten CD1d Dimere, und langwierige Kultur mal einige veröffentlichten Protokollen weniger ethisch und wirtschaftlich attraktiv 9,13. In diesem Bericht beschreiben wir ein angepasstes Verfahren zur Isolierung und in vitro-Expansion der iNKT Zellen aus der Milz der Maus. Genauer gesagt, das Protokoll beschreibt ein Verfahrenzur Anreicherung iNKT Zellen aus der Milz der Maus, die die Mäuse, Reagenzien und Zeit für FACS Zellsortierung erforderlich, reduziert, und schlägt vor, einen optimierten Ansatz für den Ausbau der sortierten Milz iNKT Zellen in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-2</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-12</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>39-8122-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0032-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD8&#945; (53-6.7)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>11-0051-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-conjugated anti-mouse CD3&#949; (500A2)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>560771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12633-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-056</td>
			<td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00 AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate F-bottom</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>188-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>227-261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

Die Fähigkeit, schnell zu sezernieren Zytokine bei Stimulation ist ein funktionelles Merkmal der invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zelllinie. iNKT Zellen werden daher als einer angeborenen T-Zellpopulation in der Lage, die Aktivierung und Steuerung der adaptiven Immunantwort aus. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Kultivierung und Expansion murine iNKT Zellen erleichtert die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in in vitro und in vivo-Modellsystemen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Expansion von murinen Milz iNKT Zellen. Milz von C57BL / 6-Mäusen entfernt, seziert und gespannt, und die resultierende Zellsuspension wird über Dichtegradientenmedien geschichtet. Nach der Zentrifugation werden Milz mononuklearen Zellen (MNC) gesammelt und CD5-positive (CD5 +) Lymphozyten werden für die Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert. iNKT Zellen innerhalb des CD5 + -Fraktion anschließend mit gefärbten ^5; GalCer belasteten CD1d Tetramer und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt. FACS sortiert iNKT Zellen werden dann zunächst in vitro unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten murinen Zytokine und plattengebundenen T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimuli, bevor sie in der Gegenwart von rekombinantem murinem IL-7 erweitert. Unter Verwendung dieser Technik etwa 10 8 iNKT Zellen können innerhalb von 18-20 Tagen Kultur, wonach sie für funktionelle Assays in vitro, oder in vivo Transferexperimente bei Mäusen verwendet werden, erzeugt werden.

Isolierung von Milz mononukleären Zellen mit einem Dichtegradienten dauert etwa 1 Stunde und eliminiert die Verwendung von Reagenzien erforderlich ist, um rote Blutkörperchen (RBCs) lysiert. Eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens und Schmutz während des Pressen des Organs entfernt erzeugten erhalten. Typischerweise liegt die Frequenz der iNKT Zellen innerhalb der Milz-Lymphozyten-Pool im Bereich zwischen 1 und 5% der gesamten T-Lymphozyten kann dies jedoch je nach Alter, Geschl...

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An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Aufrufe.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

Serie: An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Zusammenfassung

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