This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt. 1. Vollblut-Sammlung <ol><li> Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist ziehen Blut nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation Richtlinien. </li><li> Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen , das Di-Kalium Ethylendiamintetraessigsäure (K 2 EDTA). Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zur Trennung. </li></ol> 2. Vorbereitung der OVI-markierten Zielzellen <ol><li> Wachsen K562-Zellen in Komplett Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin mehrere Wochen lang vor dem Assay auf die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten. Stellen Sie die KonzentratIonen der Zellen bis 3 x 10 5 Zellen / mL der Fertigstellung einer Zelle täglich durch Zählen und anschließende Passage von Zellen. Führen Sie eine vollständige Medienwechsel alle 2 bis 3 Tage. </li><li> Am Tag des Tests, führen Sie eine 1 ein Zellenzahl: 1 - Hämozytometer. <ol><li> Entfernen 10 &amp; mgr; l aus dem K562 Kolben aufnehmen und in 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Zugabe von 10 ul Trypanblau-Farbstoff in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen für einen Verdünnungsfaktor von 1: 1. </li><li> Sanft flick Rohr K562-Zellen und Trypanblaufarbstoff zu mischen. </li><li> Erlauben K562 Zellen Trypanblau für 1 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Entfernen 15 &amp; mgr; l von gefärbten K562-Zellen aus dem Rohr. </li><li> Pipette auf Hemocytometer für Zellzahl. </li><li> Zählen von Zellen in den vier Eckquadrate sowie den mittleren Platz für insgesamt fünf Plätzen. </li><li> Berechnen Zellzahl unter Verwendung der Gleichung: Insgesamt Zellen / ml = Gesamt Zellen gezählt X (Verdünnungsfaktor / Anzahl der Quadrate) X 10000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Resuspendieren K562 - Zielzellen zu einer endgültigen Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in serumfreiem IMDM - Kulturmedium. </li><li> Für ungefärbte K562 - Zielzellen, 10 ml von K562 - Zielzellen zu einem 15 ml - Röhrchen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen. In eine 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung. </li><li> Dio gefärbten K562 - Zielzellen, mit 10 ml K562 - Zellen zu einem 15 ml - Röhrchen mit einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml für insgesamt 10 x 10 6 K562 - Zellen abzielt. <ol><li> 1 &amp; mgr; l der OVI Zellmarkierungslösung pro ml Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen Dio-Färbung bezeichnet und sanft Wirbel. Beispielsweise 10 &amp; mgr; l Lösung DiO Zellmarkierungs bis 10 x 10 6 K562 Zellen / ml in einem Volumen von 1 x 10 6 Zellen / ml hinzu. </li><li> Inkubieren K562-DIO - Lösung für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem 15 ml Röhrchen. </li></ol></li><li> Folgening Inkubation 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf K562-DIO-Lösung 15 ml Röhrchen mit. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 135 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand, ohne mit einem 1000 ul Volumen verstellbare Pipette das Zellpellet zu stören. </li><li> In 10 ml frischem IMDM zu Zellpellet enthaltenden 15 ml-Röhrchen. </li><li> Sanft Wirbelrohr um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,10 zwei weitere Male. </li><li> Store - Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Zellen können bis zu 24 h im Brutschrank gelagert werden, aber es ist bevorzugt, sie am selben Tag zu verwenden. </li></ol> 3. Herstellung von Kontrollen <ol><li> Übertragen Sie die folgenden in getrennte und in geeigneter Weise 1,5 - ml - Röhrchen beschriftet: <ol><li> Add 500 ul frischem IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den &quot;Double Positive&quot; bezeichnet 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> In 500 ml frisches IMDM, enthaltend erneut suspendiert DiO-markierte K562-Zellen in den &quot;DiO nur&quot; etikettiert 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> In 500 ul frischem IMDM enthält, erneut suspendiert unmarkierten K562-Zellen in den &quot;Propidiumiodid (PI) nur&quot; etikettiert 1,5 ml-Röhrchen. </li></ol></li><li> Der doppelte Positive und PI nur Röhrchen in einem 55 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Nach dem 5 Minuten verstrichen ist, entfernen Sie Rohre und wischen Sie mit 70% Ethanol nach unten. </li><li> In 10 l PI an das Doppel Positive und PI nur 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Platzieren alle drei K562 Zielzelle steuert in dem Inkubator bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Nach der 30 min Inkubation Ablauf Zentrifuge alle Steuerelemente Zielzelle K562 drei für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren jede Steuerung mit 20 &amp; mgr; l frischem IMDM Zellkulturmedien, und lassen Sie in der 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für mindestens30 min für eine optimale DiO Signal. HINWEIS: Die Kontrollen sind nun bereit, cytometer durch die Abbildungsfluss ausgeführt werden. </li></ol> 4. NK-Zellen Automatisierte Trennung <ol><li> Schalten Sie Zellseparator und lassen Sie den Start-up-Zyklus zu beenden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeit Flaschen Illuminationen sind grün und dass die Abfallflasche ist leer. </li><li> Besorgen Sie sich eine Raumtemperatur 15 ml-Röhrchen-Rack. HINWEIS: Die Auswahl basiert auf Probenvolumina. Zum Beispiel für ein Volumen von weniger als 3 ml verwenden, um ein 15 ml Röhrchen Zahnstangen- und für ein Volumen von mehr als 3 mL verwenden, um eine 50 ml-Röhrchen Rack. </li><li> Label-Probenröhrchen entsprechend (Wiederholung pro Probe / Teilnehmer): Teilnehmer 1 Vollblut-Probe; Teilnehmer 1 Negativ-Fraktion; Teilnehmer 1 Positive Fraktion. </li><li> Pipette vorsichtig 1,5 ml Vollblut aus Schritt 1.2 in &quot;Vollblut-Probe&quot; 15 ml-Röhrchen. </li><li> Legen Sie entsprechend markierten 15 ml &quot;Vollblut-Probe&quot; Röhrchen aus Schritt 4.5 und markierte 15 ml &quot;Negative Fraktion&quot; und&quot;Positive Fraktion&quot; Rohre aus Schritt 4.4 in der Rohrgestell. Verwenden Sie thefollowing Probenrack Set-up: Reihe (R1) A: Vollblut-Probe, Reihe (R2) B: Negativ, unmarkierten Fraktion, Reihe (R4) C: Positiv, magnetisch markierten Fraktion. </li><li> Legen Sie die Separator-Rack auf den Minisampler für autolabeling. </li><li> Wählen Sie &quot;Reagenz&quot; auf dem Menü und markieren Sie die Position, wo das Fläschchen wird in dem Separator Rack platziert werden. </li><li> Wählen Sie &quot;Read-Reagenz&quot;, um den 2D-Code-Leser zu aktivieren. </li><li> Legen Sie das entsprechende Reagenzabfüllung vor dem 2D-Code-Leser zwischen 0,5-2,5 cm von dem Codeleser Abdeckung. HINWEIS: Zum Beispiel ist die erforderliche Reagenz für NK Zelltrennung CD56. </li><li> Halten Reagenzabfüllung in einem Winkel vor 2D-Code-Leser für die optimale Lese. </li><li> Legen Sie die Reagenzabfüllung in die richtige Trennzeichen Rackposition. </li><li> Markieren Sie die gewünschten Positionen unter der Trennung Registerkarte auf dem Bildschirm. </li><li> Aus dem Labeling Untermenü zuweisen ein Autolabeling Programm. </li><li> die Zellseparation Reagenz CD56 MicroBeads Weisen Positionen Rack 1, 2, 3 und 4. </li><li> Wählen Sie den &quot;posselwb&quot; Trennung Programm. </li><li> Wählen Sie den &quot;spülen&quot; Waschprogramm. </li><li> Legen Sie ein Probenvolumen von 1.500 &amp; mgr; l in der &quot;Lautstärke&quot; Untermenü mit der Zifferntastatur. </li><li> Wählen Sie die &quot;Enter&quot; auf der Tastatur. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot;, um die Zelltrennung starten. </li><li> Wählen Sie &quot;OK&quot;, um zu bestätigen, dass genügend Puffer für die Bearbeitung aller Proben zur Verfügung steht. </li></ol> 5. NK Cell Count Nach Zellseparation <ol><li> Unmittelbar im Anschluss an die Zelltrennung mit dem Zellseparator, rufen Sie die positive Fraktion. Lassen Sie bei Raumtemperatur. Diese Fraktion enthält die gewünschten reinen NK-Zell-Population. </li><li> Für jede einzelne Probe, führen Sie eine Zellzahl einer Zählkammer gemäß Schritt 2.2 verwendet wird . <ol><li> Nach Berechnungen, die Zellenzahl aufzuzeichnen. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Zytotoxizitätstest Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten Sie und beschriften entsprechend 1,5 ml Röhrchen für jede Probe / Teilnehmer. </li><li> Pipette gewünschte Verhältnis von NK-Zellen und DiO-labled K562-Zellen in jedes Röhrchen. HINWEIS: Zum Beispiel ist das gewünschte Verhältnis von K562-Zielzellen und Effektorzellen NK 1: 5. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 135 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren NK-DiO markierten K562 Zellgemisch in 500 &amp; mgr; l von NK-Zell-Medium ohne Interleukin-2 (IL-2) und 2-Mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK Zellkulturmedien). HINWEIS: Die unvollständige NK Zellkulturmedien ist, Minimum Essential Medium Eagle mit Natriumbicarbonat, ohne L-Glutamin, Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden. </li><li> Werden 5 ul PI zu jedem Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h. </li><li> Nach 2 h Inkubation centrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendiere Zellen in 25 ul unvollständiges NK Zellkulturmedien. </li></ol> 7. Herstellung von Spontaneous ( &quot;S&quot;) Probe <ol><li> Pipette 500 ul DiO-markierte K562 - Zellen (Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml) in 1,5 ml - Röhrchen. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von PI zu jedem Röhrchen. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 2 min bei 163 x g. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C für 2 h. </li><li> Folgenden 2 h Inkubation Zentrifuge für 2 min bei 163 x g. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Die Zellen in 25 ul unvollständig alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) Zellkulturmedien. </li></ol> 8. Datenerfassung mit Imaging Durchflusszytometer <ol><li> Drücken Sie die grüne Taste in der vorderen Tür des Abbildungs ​​Durchflusszytometer auf das Gerät einzuschalten. </li><li> Schalten Sie all Computer mit der Imaging-assoziierten Durchflusszytometer. </li><li> Starten Sie die Imaging-Durchflusszytometer Software. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Inbetriebnahme&quot;, um das System zu spülen und die Probenleitung vorzubereiten. </li><li> Sobald die &quot;Inbetriebnahme&quot; abgeschlossen ist, schließen Sie das &quot;Calibra&quot; Fenster. </li><li> Weisen Sie Kanäle: auf der oberen linken Seite, klicken Sie auf jedem Kanal, um sie zu vergeben. </li><li> Auf der rechten Seite klicken Sie auf den Streudiagramm-Taste 4 Scatterplots zu erstellen: Rohmaterial Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Rohmaterial Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Rohmaterial Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 und FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Beginnen Analyse von Proben , indem zuerst die &quot;Double Positive&quot; Steuerung. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Laden&quot;. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem &quot;Double Positive&quot; Probe aus den Schritten von 3,4 bis 3,9 in den Probenlader. </li><li> Wählen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; aus. </li><li> Schalten Sie die 405 mW und642 mW Laser. </li><li> Schalten Sie das &quot;Hellfeld&quot; Kanal. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Intensität.&quot; </li><li> Basierend auf dem &quot;Double Positive&quot; Kontrollprobe, bestimmen die gewünschte Intensität für die 405 mW Laser so dass der Detektor nicht überlastet wird. Hinweis: Zum Beispiel wurde bei 11 mW die optimale Intensität für dieses Experiment eingestellt. </li></ol></li><li> Nachdem die gewünschte Set-up erreicht, Daten erfassen. <ol><li> Im Rahmen der &quot;Acquisition Datei&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text. Wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendatei (en). </li><li> Geben Sie die Anzahl der Zellen neben &quot;Collect&quot; zu erwerben. Typischerweise variiert diese Zahl zwischen 1.000 bis 10.000. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen gewonnen wird, wird die Datendatei in dem zuvor ausgewählten Ordner automatisch gespeichert. </li></ol></li><li> Nach dem Erwerb abgeschlossen ist , legen Sie die nächste Kontrollprobe - DiO nur Kontrolle. </strong&gt; <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Laden&quot;. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit dem &quot;DiO nur&quot; Probe in die Probenzuführung. </li><li> Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; Registerkarte ausgewählt. </li><li> Lassen Sie das 405-mW-Laser eingeschaltet. </li><li> Schalten Sie den 642-mW-Laser und das &quot;Hellfeld&quot; Kanal. HINWEIS: Nun, da die gewünschte Set-up erreicht wurde, können die Daten erfasst werden. </li><li> Unter dem &quot;File Acquisition&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie die Anzahl der Zellen neben erwerben &quot;sammeln.&quot;. Typischerweise ist diese Zahl 1000. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 8,10 für die &quot;PI nur&quot; Kontrollprobe. Die experimentellen Proben sind nun bereit, gesammelt werden. </li><li> Behandeln Sie die remaining experimentellen Proben, einschließlich der &quot;Spontane&quot; S &quot;Samples&quot; wie folgt: <ol><li> Lassen Sie das 40X-Objektiv unter der &quot;Vergrößerung&quot; Registerkarte ausgewählt. </li><li> Schalten Sie die 405 mW und 642 mW Laser. </li><li> Schalten Sie die &quot;Hellfeld&quot; Kanal. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Set Intensität.&quot; </li><li> Unter dem &quot;File Acquisition&quot;, geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text und wählen Sie die Datendatei einen Ordner für das Speichern (s). Geben Sie in einem benutzerdefinierten Dateinamen Text. </li><li> Geben Sie die Anzahl der Zellen zu erwerben neben &quot;sammeln.&quot; </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot;. HINWEIS: Wenn die gewünschte Anzahl von Zellen, die Datendatei automatisch in dem zuvor ausgewählten Ordner gespeichert wird, erfasst wird. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 8.12 für alle experimentellen Proben. </li><li> Nachdem alle experimentellen Daten und Dateien gesammelt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Shutdown&quot; um das System zu sterilisieren. </li></ol> 9. Imaging Durchflusszytometer Probenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Imaging-Durchflusszytometer-Analyse-Software-Anwendung. </li><li> Unter &quot;Datei&quot;, öffnen Sie eine experimentelle .RIF Datei. </li><li> Erstellen Sie eine neue Matrix, die die einzelnen Farb .RIF Dateien mit (DIO-only steuern und PI-only-Steuerung, erstellt während der Schritte 8.10 und 8.11), indem Sie &quot;Erstellen einer neuen Matrix&quot; unter der Kompensation Registerkarte in der Abbildungs ​​Durchflusszytometer Software. HINWEIS: Die Software fordert für die Auswahl der einzelnen Farbdateien und kombiniere sie mit einer Matrix-Datei (.ctm Dateierweiterung) zu erstellen, dh ausgewählt werden Kanalkompensation anzuwenden. </li><li> Erstellen Sie Dot - Plots unter Verwendung der &quot;Bausteine&quot; Funktion der Software. <ol><li> Erstellen Sie ein Punkt-Plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequenz) die fokussierten Zellen Tor. Rufen Sie das Tor &quot;Focus&quot; (Abbildung 1A). </li><li> den &quot;Focus&quot; Tor benutzen, ein Punkt-Diagramm von Bright Field Bereich vs Hell Feld Seitenverhältnis g schaffen<html> aßen die Singulett-Zellen. Rufen Sie das Tor &quot;Single&quot; (1B). </li><li> Mit dem &quot;Single&quot; Tor, erstellen Sie ein Punktdiagramm von Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Verwenden Sie diese Handlung zu identifizieren und Gate DiO-positive Zellen nur (Ziele, lebendig) und PI-DIO doppelt positiven Zellen (Targets, tot) (1C). HINWEIS: Alle Grundstücke in den Schritten 9.4.1, 9.4.2 und 9.4.3 kann unter Verwendung der &quot;Bausteine&quot; Funktion der Software erstellt werden. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf die Statistik-Funktion des Dot-Plot zu Zellzahlen von jedem Gate zugreifen. </li><li> Berechnen Sie den Prozentsatz der toten Ziele in der spontanen Probe und experimentellen Proben unter Verwendung folgender Formel: % Tote Ziele in Probe = (#dead Ziele x 100) / (# leben Ziele + #dead Ziele) </li><li> Berechnen Zytotoxizität unter Verwendung der folgenden Formel: % Zytotoxizität = [(Experimental dead-Spontane tot) / (100-Spontane tot)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Histogramme, Streudiagramme und Bilder für zytotoxische Aktivität Analyse. (A) Fokus Zellanalyse. (B) Einzelzellanalyse. (C) Zielzellfärbung Analyse. Alle Bestimmungen werden unter Verwendung des Bildes zu jedem Ereignis angebracht gemacht. Dies kann durch einfaches Klicken auf die Veranstaltung in den Diagrammen in der Analyse-Software zugegriffen werden. (D) repräsentatives Bild eines Dubletts Ereignis, eine apoptotische NK - Zellen und eine Live - K562 Ziel zeigt. Ch01, Hellfeld. Ch02, OVI. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Das Verfahren in dieser Studie beschriebenen Maßnahmen direkt auf die spezifische Aktivität eines NK-Zellen des Individuums als Reaktion auf Reize (in diesem speziellen Fall längerer Übung). Typischerweise werden NK-Zellen aus einem das Blut unter Verwendung von Dichtegradienten oder eine Zelle durch die Verwendung einer Kombination von Markern Sortierung isoliert. Obwohl diese Verfahren weit verbreitet sind, haben sie viele Nachteile: sie zeitraubend sind, beinhalten mehrere Manipulationen und sind stark Benutzer a...

Natürliche Killerzellen sind ein wesentlicher Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Während sie sehr geregelt werden, haben sie die Fähigkeit , zu erkennen und abnormalen Zellen durch Zell-zu-Zell - Kontakt und ohne vorherige Aktivierung 1 beseitigen. Als solche bilden sie eine schnelle Verteidigungslinie gegen Infektionen. Exercise, besonders intensiv, wurde gezeigt , dass die transient das Immunsystem 2, 3, 4, 5 drücken. NK - Zellen sind besonders anfällig für diese Wirkung 4, 6, 7, effektiv ein Fenster mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Krankheiten zu schaffen. Daher, bevor die Untersuchung von Interventionen, während oder nach intensivem Training mit dem Ziel, ihre Auswirkungen zu verringern auf NK-Zell-Funktion ist von besonderem Interesse für das Wohlbefinden der Athleten post-Wettbewerben. 8, bei etwa 1% der weißen Blutkörperchen Fach; 2) NK-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber Stress und verlassen sich auf ständige Exposition gegenüber physiologischen Bedingungen während des Experimentierens lebensfähig und stabil zu bleiben; und 3) Standardassays NK - Zell - Cytotoxizität zu bestimmen, wie beispielsweise Ficoll - Gradienten 9 und Freisetzungsassays 10, sind unzuverlässig und inkonsistent. Die inhärente Variabilität der menschlichen Proben nur diese Fragen Verbindung. Frischen menschlichen Proben bei Eingriffen gesammelt sind ziemlich geregelten und schwer zu beschaffen, zumindest im Vergleich zu den Tierproben oder immortalisierten Zelllinien. Dies reduziert die Möglichkeiten Experimente zu wiederholen, oder fügen Sie die Teilnehmer der Studie Kohorte signifikanten statistischen Schwellenwerte zu erreichen. Zusammengefasst unterstützen diese Fragen die Notwendigkeit für eine optimierte Protokoll, das fo erlaubtr beide Hochdurchsatz und eine Hochzuverlässigkeitsanalyse von NK-Zell-lytische Aktivität in menschlichen Proben. Wir haben ein Workflow, der die notwendige Zeit zu identifizieren, zu isolieren und zu testen NK-Zellen aus menschlichem Vollblut verkürzt, während der Exposition gegenüber äußeren Faktoren zu minimieren. Das Verfahren optimiert die Verwendung von zwei Instrumenten, eine Magnetbasis Zellsortierer und eine Abbildungs ​​Durchflusszytometer und eine Assay-spezifische, optimierte T: E-Verhältnis die Detektion abnimmt oder zunimmt von NK-Zell-Cytotoxizität zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymphoblasts</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Tissue culture grade</td></tr><tr><td>Propridium Iodide Staining Solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cell-labeling solution</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>No calcium or magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, September 2013</td></tr><tr><td>Ideas Application Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, July 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

NK-Zell-Cytotoxizität ist eine weit verbreitete Maßnahme, um die Wirkung der Intervention von außen auf NK-Zell-Funktion zu bestimmen. Jedoch kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays instabil betrachtet werden, entweder weil der Benutzer-Fehler oder wegen der Empfindlichkeit von NK-Zellen auf experimentelle Manipulation. Um diese Probleme zu beseitigen, wird ein Workflow, der sie auf ein Minimum reduziert wurde etabliert und wird hier vorgestellt. Zu veranschaulichen, erhalten wir Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten, von Läufern (n = 4), die zu einem intensiven Trainingseinheit vorgelegt wurden. Zunächst werden NK-Zellen gleichzeitig identifiziert und isoliert durch CD56-Tagging und magnetische-basierte Sortierung, direkt aus Vollblut und von so wenig wie ein Milliliter. Die sortierten NK-Zellen sind von irgendwelchen Reagenz oder Capping-Antikörper entfernt. Sie können, um gezählt werden, eine genaue NK-Zellzahl pro Milliliter Blut zu schaffen. Zweitens können die sortierten NK-Zellen (Effektoren Zellen oder E) mit 3,3&#39;-Diotade gemischt werdencyloxacarbocyanine Perchlorat (DIO) markierte K562-Zellen (Zielzellen oder T) bei einem Test-optimal 1: 5 T: E-Verhältnis, und analysiert, um eine Bildgebungs Durchflusszytometer verwenden, die für die Visualisierung jedes Ereignisses und die Beseitigung aller falschen positiven erlaubt oder falsch-negative Ergebnisse (wie Dubletten oder Effektor-Zellen). Dieser Arbeitsablauf kann in etwa 4 h vollendet werden, und ermöglicht eine sehr stabile Ergebnisse, selbst wenn sie mit menschlichen Proben arbeiten. Wenn verfügbar, Forschungsteams können mehrere experimentelle Eingriffe am Menschen zu testen und zu vergleichen, Messungen über mehrere Zeitpunkte, ohne die Datenintegrität zu beeinträchtigen.

Bestimmung der NK-Zellzahl Die Wirkung von schweren Lauf auf NK - Zellzahl im Vollblut wurde gemessen, die Übung Protokoll in Abbildung 2 beschrieben ist . Blutproben wurden vor dem Training gezogen, unmittelbar nach dem Training, 1,5 Stunden nach dem Training, und schließlich 24 und 48 Stunden nach der ersten Blutentnahme. Die Konzentration von NK - Zellen pro Milliliter Vollblut wurde für jede Kufe (3A) gemessen und im Schnitt (Figur ...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Aufrufe.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Serie: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Bewertung menschlicher natürlicher Killerzellereignisse, die durch fcγRIIIa Engagement in Gegenwart therapeutischer Antikörper angetrieben werden

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

<meta charset="utf8"></head><body>Profilierung des menschlichen Rezeptor-Liganden-Repertoires an natürlichen Killerzellen

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Profilierung des menschlichen Rezeptor-Liganden-Repertoires an natürlichen Killerzellen

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Medizin

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Zusammenfassung

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Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Bewertung menschlicher natürlicher Killerzellereignisse, die durch fcγRIIIa Engagement in Gegenwart therapeutischer Antikörper angetrieben werden

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Profilierung des menschlichen Rezeptor-Liganden-Repertoires an natürlichen Killerzellen

Profilierung des menschlichen Rezeptor-Liganden-Repertoires an natürlichen Killerzellen

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Natürlicher Killerzell-vermittelter Zytotoxizitätsassay Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse