Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KFO 196 &quot;Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen&quot;, FR 1638 / 1-2) und vom DZHK (Deutsches Zentrum für Kreislaufforschung, einem Teil der German Centres of Health Research , die eine BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung) Initiative) ist.

HINWEIS: Die Grundschritte des Isolationsverfahren sind in Abbildung 1 dargestellt Alle Schritte werden ausführlich in dem folgenden Protokoll beschrieben.. Papillarmuskel Isolation, Montage im Organbad Kammer, Erfassung und Auswertung wird in einer fortlaufenden und obligatorische Zeitskala durchgeführt. Alle Tierversuche wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren durchgeführt und wurden von der Ethikprüfung Board of Universität Heidelberg genehmigt. 1. Vorbereitung der Besetzung <ol><li> Für Kontraktionsmessungen verwenden eine Mehrkammer Organbad Setup. Komponenten einer ex vivo Kontraktilität Organbad Einrichtung sind in Abbildung 2 dargestellt. HINWEIS: Um die Zeitspanne zwischen der Herstellung der Papillarmuskel und dem Beginn der Versuchsprotokoll, einzurichten Geräte minimieren und vor vorzubereiten Puffer, um das Sammeln experimenteller tissue.This provides die größte Menge an Zeit, die das Gewebe lebensfähig bleibt, um Experimente durchzuführen. </li><li> Starten Sie Computer und Datenerfassungsgeräte. Schalten Sie Organbad Wärme (Werkseinstellung auf 32 ° C) und lassen Einheiten voreingestellte Temperatur. </li><li> Bereiten Sie den Erfassungsgeräten. Starten Sie die Aufnahme-Daten als im Softwarehandbuch erwähnt. </li><li> Prüfen und Durchführung der Kalibrierung (falls erforderlich) auf jedem Kanal und Null alle Kanäle, die von den jeweiligen Kraftwandler (mit dem Kanal zugeordneten) zugeführte elektrische Signal zu einem von einem zertifizierten Gewichts versorgt 2-g-Kraft zu standardisieren. </li><li> Schalten Sie Gasversorgung (95% O 2/5% CO 2) um Organbad Kammern. Kontinuierlich Gas alle Kammern während der gesamten Protokoll-Messungen. </li></ol> 2. Herstellung von Puffern und physiologischen Lösungen <ol><li> Vorbereitung einer Krebs-Henseleit-Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 119 mM NaCl zu erreichen; 25 mM NaHCO 3; 4,6 mM KCl; 11 mM Glucose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl 2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2 PO 4 und pH-Wert auf 7,4 (siehe Tabelle 1 Physiologische Lösung). </li><li> Bereiten separaten Krebs-Henseleit-Pufferlösung, um während der Isolierung zu verwenden, wie in Schritt 2.1 mit zusätzlichen 30 mM 2,3-Butan Monoxim (BDM) und 50 IE Heparin / ml beschrieben. Coole Lösung auf 4 ° C (siehe Tabelle 1: Herstellung Lösung). Ischämie Simulation vorbereitet Ischämie-Lösung, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Für das Protokoll des Ca 2 + - abhängigen Kontraktilität, fügen Ca 2+ zu der Krebs-Henseleit-Pufferlösung zu angeforderten Endkonzentration. HINWEIS: bereiten diese Lösungen direkt vor seiner Verwendung und Gass mit Carbogen um die Ausfällung von Calciumcarbonat zu vermeiden. Vorwärmen Lösung auf 32 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Herstellung der Begasungsrohr und Dissection Dish während des Papilläre Excision Procedure verwendet <ol><li> Schließen Sie einen weichen Gassingen Rohr (Außendurchmesser 2-4 mm) auf den Gasanschluss (100% Sauerstoff, Carbogen alternativ) mit Expertenarbeits. </li><li> Erstellen Sie einen geschlossenen Ring der Begasung Rohrverbindung innerhalb der Dissektion Gericht. Punktion der Vergasungsrohr mehrmals, dass ein kontinuierlicher Blasenbildung gewährleistet ist. Diese Begasungsrohr kann mehrmals verwendet werden. </li><li> Vorbereitung Dissektion Schale mit einem Silikonelastomer an der Unterseite (0,5 cm dick), so dass die Stifte in sie gesteckt werden. Dieses Gericht kann mehrmals verwendet werden. </li></ol> 4. Isolierung des linken vorderen Papillarmuskel von Mäusen HINWEIS: Vor dem Start der Isolierung der Papillarmuskel, überprüfen, dass die Gasleitungen frei von Blockaden. <ol><li> Bereiten Organbad Setup wie im Protokoll Abschnitt 3.1 erwähnt, bevor die Vorbereitung der Papillarmuskeln. Bereiten alle Lösungen am Tag des Experiments. </li><li> Opfern Sie die Maus (ungefähr 8-12 Wochen alt) durch Genickbruch according Expertenarbeits und institutionellen Richtlinien. </li><li> Befestigen Sie das Tier in Rückenlage durch Fixierung Vorderpfoten und Hinterpfoten auf einer Dissektion Bord, öffnen Sie die Thoraxseiten auf beiden Seiten durch Schneiden durch die Rippen mit scharfen Knochen Schere, schneiden Sie dann die Membran mit einem Querschnitt. Entfernen Sie den Herzbeutel. Nun das Herz und die Aorta sind zugänglich. </li><li> Befestigen Sie das Herz mit stumpfen Pinzette auf das Gefäß truncus der Nähe des Herzens und trennen Sie die Herzen schnell mit einer Schere aus der Lunge und dem umgebenden Gewebe. </li><li> Übertragen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale mit gekühlten Präparationslösung mit Sauerstoff (Schritt 2.2) vergast gefüllt. Lassen Sie das Herz zu schlagen und zu stimulieren Herzkontraktionen sanft über Berührung der Herzspitze mit einer Pinzette. </li><li> Sobald das Herz ist völlig exsanguinous, überträgt es auf die Dissektion Gericht mit gekühlten Präparationslösung (Schritt 2.2) gefüllt und mit O 2 begast. Von diesem Schritt auf den Einsatz ein Stereomikroskop. </li><li> Befestigen Sie das heaRT mit einem kleinen Stift durch die rechte Herzkammer, so dass das Herz von dorsal gesehen (rechte Ventrikel auf der rechten Seite aus Sicht des Bedieners befindet). </li><li> Mit Hilfe mikrochirurgischen Schere trennen die beiden Atrien auf der AV-Ebene, schneiden Bindegewebe von den Ventrikeln und entsorgen. Führen einen Schnitt durch die Kammerwand von der AV-Ventil-Pegel auf den Apex des Herzens Vermeidung jeglicher mechanischen Druck. </li><li> Öffnen Sie die Herzkammer und befestigen Sie den linksseitigen freien Wand mit einer Pinzette, damit er einen Blick auf beide linksventrikulären Papillarmuskeln. </li><li> Die ventrikuläre Gewebe lateral auf beiden Seiten der linken vorderen Papillarmuskel Erhaltung eines Teils der Klappensegel am Papillarmuskel Vorbereitung etwas weggeschnitten und berühren oder Dehnen der Papillarmuskel so viel wie möglich. Präparieren Sie die restlichen Ventrikelwand Gewebe aus dem Papillarmuskel. </li><li> Bringen Seidenfaden (7/0, metrisch 0,5) auf beiden Seiten der Papillarmuskel preptung, eine auf der Klappensegel und eine auf der Muskelteil. Befestigen Sie die Zubereitung in das Organbad Kammer mit Organbad Lösung gefüllt und mit Carbogen begast, wie Temperatur 32 ° C empfohlen. </li></ol> 5. Equilibrierung und Stimulation der Papillarmuskel <ol><li> Stimulieren die Papillarmuskel Zubereitung mit Rechteckimpulsen (Dauer 2 ms und einem Strom von 100 mA) bei Anregungsfrequenz von 1 Hz sofort nach der Fixierung im Organbad. </li><li> Stellen Sie sicher, einen häufigen Wechsel der Organbad Lösung, entweder durch kontinuierliche Veränderung oder durch häufige manuelle Wechsel (alle 5 min) nach dem Aufbau der Organbad-Typ verwendet. </li><li> Schrittweise Erhöhung der Vorspannung bis zum maximalen Zuckungskraft in erreicht. Maximalen Zuckungskraft ist erreicht, wenn die Erhöhung der Vorspannung wird von einer weiteren Steigerung in der Zuckungskraftmessungen gefolgt. </li><li> Nach 45-60 min Äquilibrierungspuffer, starten Sie den Versuchsprotokoll. </li></ol> HINWEIS: Das Versuchsprotokoll unten beschrieben umfasst Standardmanöver, um Herzkontraktilität unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu charakterisieren. In der repräsentativen Abschnitt beschreiben wir diese Protokolle im Detail zeigt auch repräsentative Ergebnisse (siehe auch Tabelle 2). <ol><li> Erfassung und Auswertung der Versuchsprotokolle <ol><li> Für die Aufnahme sollten Sie eine geeignete Software mit ausreichender zeitlicher Auflösung (Erfassungsrate ≥ 1 kHz). </li><li> Analysieren Parameter einschließlich Zuckungskraftmessungen Amplitude (Höhe), Zeit, Spannung (TTP) und halbe maximale Relaxationszeit (R 50 / tfall, respectively), wie in der Software-Programm erwähnt (als Beispiel Abbildung 5.5 ADInstruments, siehe Abbildung 4) ihren Höhepunkt erreichen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Verfahren, um die Kontraktilität von murinen Papillarmuskel in vitro, die verwendet werden können, um mehrere wissenschaftliche Fragen zu Herz Physiologie und Pathologie in Mäusen zu beantworten und um die Analyse der transgenen Linien und die Entdeckung von neuen pharmazeutischen Ansätze unterstützen untersuchen Herzfunktionsstörungen zu behandeln. Wir veranschaulichen die Anwendung dieser Methode auf physiologische, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaf...

Die Untersuchung von Proteinen, wie Ionenkanäle beziehen ihre Rolle für die Kontraktilität des Herzens ist wichtig, verschiedene Pathomechanismen zu entdecken und neue therapeutische Strategien für Herzerkrankungen wie Ischämie und Herzversagen etablieren. Kontraktile Funktion Säugerkardiomyocyten ist bekannt, durch verschiedene Ionenkanäle, Transporter und andere Proteine ​​moduliert werden. Aktionspotential ausgelöst Aktivierung der spannungsabhängige sarkolemmalen L-Typ-Ca 2+ Kanälen führt zu Ca 2+ Einstrom von extrazellulären Raum und anschließend an Ca 2+ -induzierte Ca 2+ Freisetzung (CICR) 1, die zelluläre Kontraktions 2 auslöst. Ca 2+ -signaling eine zentrale Rolle bei der kardialen Kontraktilität und Anpassung an physiologische oder pathologische Stress spielt. Katecholamine aktivieren kardialen β-adrenergen Rezeptoren, so anregend Adenylylcyclase (AC), die cAMP synthetisiert. Aktiviert, protein Kinase A (PKA) phosphoryliert verschiedene intrazelluläre und membranassoziierten Proteinen, wie L-Typ-Ca 2+ -Kanälen, Phospholamban und Ryanodinrezeptoren was Modifikation Ca 2+ Transienten und Herzkontraktilität 1,3,4. cAMP wird von Phosphodiesterase (PDE) abgebaut wird. Aktivierung anderer als β-Adrenozeptoren Gs-gekoppelter Rezeptoren führt auch zu einer Akkumulation von cAMP. Die Technik der Kontraktilität Messungen in isolierten ventrikulären Muskel-Streifen ist gut für größere Säugetierarten 5-8 etabliert. Bezogen auf die Möglichkeit, das Gen-Targeting in Mäusen ist es wichtig, Methoden zu ermitteln und murine Herzphysiologie analysieren. Unterscheiden sich jedoch vorhandenen Daten über die physiologischen Eigenschaften isolierter Muskelpräparate Mäuse auf experimentellen Bedingungen 9-12 variiert. Das beschriebene Verfahren wird verwendet, um die Herzkontraktionsfähigkeit des linken Ventrikels Papillarmuskel pre analysierenPräparate in vitro. Untersuchung der Herzkontraktilität in Abwesenheit von Einflüssen Modifizieren Herzkontraktilität in vivo, wie Blutdruck, neurohumoral Stimulation und physikalischen oder metabolischen Stress durchgeführt. Die Schlagfrequenz des öffentlichen Muskel-Präparat kann streng definiert und beliebig verändert werden. Zuckungskraftmessungen kann im Kontext von spezifischen Stimuli wie Calciumkonzentration, Schlagfrequenz oder Temperatur analysiert werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet, um verschiedene Signalweg Komponenten zu untersuchen und die Herzleistung von genetisch veränderten Mausmodellen durch Steuern oben erwähnten Versuchsbedingungen zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 5655</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Hazard statement H 302, solve in DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Isoprenaline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5627</td><td>Hazard statement H 315-H319-H335</td></tr><tr><td>Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3874685</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7250</td><td>Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335</td></tr></tbody></table>

contractility measurements on isolated papillary muscles for the investigation of cardiac inotropy in mice

Papillarmuskel aus adulten Mäuseherzen isoliert verwendet werden, um Herzkontraktilität während verschiedene physiologische / pathologische Zustände zu untersuchen. Die kontraktilen Eigenschaften unabhängig von äußeren Einflüssen wie Gefäßtonus oder neurohumoral Status ausgewertet. Es zeigt einen wissenschaftlichen Ansatz zwischen Einzelzellmessungen mit isolierten Herzmuskelzellen und in vivo Studien wie Echokardiographie. So Papillarmuskel Präparate dienen als ein hervorragendes Modell, um Herzphysiologie / Pathophysiologie zu studieren und kann für Untersuchungen wie die Modulation durch pharmakologische Mittel oder die Erforschung der transgene Tiermodelle verwendet werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung des murinen linken vorderen Papillarmuskel zu Herzkontraktilität in einem Organbad Setup zu untersuchen. Im Gegensatz zu einer Muskelstreifen Zubereitung aus der Herzkammerwand getrennt, kann der Papillarmuskel in toto, ohne die Muskel tissu vorbereitet werdenE streng. Das Organbad Setup besteht aus mehreren temperaturgesteuerten, vergast und Elektroden ausgestattete Organbad Kammern. Isoliertes Papillarmuskel wird im Organbad Kammer befestigt und elektrisch stimuliert. Die hervorgerufene Zuckungskraftmessungen wird mit einem Druckaufnehmer und Parameter wie Zuckungskraftmessungen Amplitude und twitch Kinetik analysiert werden aufgezeichnet. Verschiedenen Versuchsprotokollen durchgeführt werden kann, um die Calcium- und frequenzabhängige Kontraktions sowie Dosis-Wirkungskurven von kontraktilen Mittel wie Katecholaminen oder anderen Arzneimitteln zu untersuchen. Zusätzlich können pathologische Zustände wie akute Ischämie simuliert werden.

Das Protokoll des Manuskripts für die Kontraktilität Messungen von isolierten Maus-Papillarmuskel Zubereitungen wird, um optimale Bedingungen abgestimmt, um reproduzierbare Versuchsergebnisse unter physiologischen Bedingungen zu erreichen. Um eine optimale Versuchsbedingungen definieren wir geführt Pilotversuche unterschiedlicher Organbad Temperatur und extrazellulären Calcium-Konzentration (siehe auch 12). Das hier beschriebene Protokoll wurde mit einer extrazellulären Calciumkonzentration von 1,5 mm un...

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Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Murine linksventrikulären Papillarmuskeln können verwendet werden, um Herzkontraktilität in vitro untersucht werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail die Isolierung und experimentelle Protokolle, um die Herzkontraktionseigenschaften zu studieren.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

contractility-measurements-on-isolated-papillary-muscles-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Aufrufe.  Universität Heidelberg.  Murine linksventrikulären Papillarmuskeln können verwendet werden, um Herzkontraktilität in vitro untersucht werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail die Isolierung und experimentelle Protokolle, um die Herzkontraktionseigenschaften zu studieren. 

Serie: Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Forschung

Medizin

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these strategies is to examine their effects on heart function. There are several techniques to measure in vivo cardiac mechanics (e.g., echocardiography, pressure/volume relations, etc.). Compared to echocardiography, real-time left ventricular (LV) pressure/volume analysis via catheterization is more precise and insightful in assessing LV function. Additionally, LV pressure/volume analysis provides the ability to instantaneously record changes during manipulations of contractility (e.g., &#946;-adrenergic stimulation) and pathological insults (e.g., ischemia/reperfusion injury). In addition to the maximum (+dP/dt) and minimum (-dP/dt) rate of pressure change in the LV, an accurate assessment of LV function via several load-independent indexes (e.g., end systolic pressure volume relationship and preload recruitable stroke work) can be attained. Heart rate has a significant effect on LV contractility such that an increase in the heart rate is the primary mechanism to increase cardiac output (i.e., Bowditch effect). Thus, when comparing hemodynamics between experimental groups, it is necessary to have similar heart rates. Furthermore, a hallmark of many cardiomyopathy models is a decrease in contractile reserve (i.e., decreased Bowditch effect). Consequently, vital information can be obtained by determining the effects of increasing heart rate on contractility. Our and others data has demonstrated that the neuronal nitric oxide synthase (NOS1) knockout mouse has decreased contractility. Here we describe the procedure of measuring LV pressure/volume with increasing heart rates using the NOS1 knockout mouse model.

This article describes the measurement of murine left ventricular function via pressure/volume analysis at different heart rates.

Herzkatheter in Mäuse, um den Druck Volumen Relationship Maßnahme: Untersuchung der Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Biotechnik

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Biologie

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Revealing Subtle Changes in Cardiac Function using Transthoracic Dobutamine Stress Echocardiography in Mice

Left ventricular (LV) dysfunction paves the final pathway for a multitude of cardiac disorders. With the non-invasive high-frequency transthoracic dobutamine stress echocardiography in humans, a reductionist investigation approach to unmask subtle changes in cardiac function has become possible. Here, we provide a protocol for using this technique in mice to facilitate expanded analysis of LV architecture and function in physiology and pathology enabling the observation of alterations in models of cardiac disease hidden in unstressed hearts. This investigation can be performed in one and the same animal and allows both, basal and pharmacologically stress-induced measurements. We outline detailed criteria for appropriate anesthesia, imaging-based LV analysis, consideration of intra- and interobserver variability, and obtaining positive inotrope response that can be attained in mice after intraperitoneal injection of dobutamine under near physiological conditions. To recapitulate the characteristics of human physiology and disease in small animal models, we highlight critical pitfalls in evaluation, e.g., a pronounced Bowditch effect in mice. To further meet translational objectives, we compare stress-induced effects in humans and mice. When used in translational studies, attention must be paid to physiological differences between mice and human. Experimental rigor dictates that some parameters assessed in patients can only be used with caution due to restrictions in spatial and temporal resolution in mouse models.

Left ventricular dysfunction constitutes the final common pathway for a host of cardiac disorders. We here provide a detailed protocol of transthoracic dobutamine stress echocardiography approach for comprehensive evaluation of the left ventricular function of mouse models of cardiac disease as well as cardiac phenotyping.

Left ventricular (LV) dysfunction paves the final pathway for a multitude of cardiac disorders. With the non-invasive high-frequency transthoracic ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...

Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

Diastolic dysfunction is a common phenotype across cardiovascular disease presentations. In addition to elevated cardiac stiffness (elevated left ventricular end-diastolic pressure), impaired cardiac relaxation is a key diagnostic indicator of diastolic dysfunction. While relaxation requires the removal of cytosolic calcium and deactivation of sarcomeric thin filaments, targeting such mechanisms has yet to provide effective treatments. Mechanical mechanisms, such as blood pressure (i.e., afterload), have been theorized to modify relaxation. Recently, we showed that modifying the strain rate of a stretch, not afterload, was both necessary and sufficient to modify the subsequent relaxation rate of myocardial tissue. The strain rate dependence of relaxation, called the mechanical control of relaxation (MCR), can be assessed using intact cardiac trabeculae. This protocol describes the preparation of a small animal model, experimental system and chamber, isolation of the heart and subsequent isolation of a trabecula, preparation of the experimental chamber, and experimental and analysis protocols. Evidence for lengthening strains in the intact heart suggests that MCR might provide new arenas for better characterization of pharmacological treatments, along with a method to assess myofilament kinetics in intact muscles. Therefore, studying the MCR may elucidate a path to novel approaches and new frontiers in the treatment of heart failure.

Rapid myocardial and cardiac relaxation is essential for normal physiology. Mechanical relaxation mechanisms are now known to be dependent on strain rate. This protocol provides an overview of the acquisition and analysis of experiments to further study the mechanical control of relaxation.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

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