Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Alle Tierpflege und Experimente wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll, das von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt wurde. Cocem3D stammten aus einer Kombination der zuvor veröffentlichten Protokollen 10,11 und wurde hier angewendet, um eine bestimmte enteroendokrine Zelle unter Verwendung eines Reporter PyyGFP Maus 12 zu studieren. Dieses Verfahren kann leicht auf andere Zellen von Interesse unter Verwendung von kommerziell erhältlichen transgenen Mäuse Reportergen angewendet werden. Correlative Konfokalmikroskopie serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) und Datendarstellung in 3D: Das Verfahren wird in drei Abschnitten beschrieben. Korrelat konfokale Mikroskopie Das Ziel dieses Abschnitts ist es, eine Gewebesegments aus dem distalen Kolon von Dimensionen, die korrelative konfokale Bildgebung SBEM ermöglichen ernten. Das Protokoll ist wie folgt: 1. Ernten der Tissue <ol><li> Bereiten10 ml von 50 ug / ml Heparinlösung in PBS. </li><li> Vorbereitung Xylazin / Ketamin Narkose Lager durch Mischen von 10 ml Ketamin (100 mg / ml) und 1 ml Xylazin (20 mg / ml). <ol><li> Verdünnen Xylazin / Ketamin Lager 1: 4 in 0,1 M PBS. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 100 ml Fixierlösung mit 4% Paraformaldehyd und 0,1% Glutaraldehyd in PBS. </li><li> Betäuben eine PyyGFP Maus, 6 bis 10 Wochen alt, mit einer letalen Dosis von Xylazin / Ketamin-Narkose. Spritzen Sie die Narkose intraperitoneal mit 0,15 ml pro 20 g Mausgewicht. </li><li> Bestätigen Sie die richtige Maus Betäubung durch Einklemmen des Schwanzes oder Zehen, und verwenden Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie eine variable Strömungs peristaltische Pumpe zu Fixiermittel intrakardial 10 durchströmen. Verwendung chirurgische Scheren (13 cm Länge) geschnitten öffnen Sie die Bauchhöhle, den Darm, Herz und Lunge aus. Halten Sie Herz mit Schmal Muster gebogenen Pinzette (12 cm Länge), und setzen Schmetterlingsnadel (19 G) aus Schlauchpumpe into linken Ventrikels. Unmittelbar, schneiden rechten Vorhof mit Feder geraden Schere (Länge 4 mm). Perfusion mit einer Geschwindigkeit von 2 ml / min zunächst mit Heparin-Lösung für 1 min, und dann mit eiskaltem Fixierungslösung für 15 Minuten, bis der Maus den Schwanz ist völlig starr. Anmerkung: Es ist sehr wichtig, um bei einer langsamen Rate zum Bersten der kleinen Gefäße in der Darmschleimhaut verhindert perfundieren. Platzen der Schiffe wird Ultrastruktur des Gewebes beeinträchtigen. Wenn Perfusion angemessen ist, die Leber sollte blass in der Farbe innerhalb 3-5 min drehen. </li><li> Mit Hilfe einer kleinen Schere öffnen Sie die Bauchhöhle und der Verbrauch den gesamten Dickdarm von der Kreuzung mit der Blinddarm zum distalen Rektum. Legen Sie das Gewebe in eiskaltem PBS. Während in PBS eingetaucht, aufgeschnitten mit kleinen Feder Schere den Doppelpunkt entlang der Mesenterium. </li></ol> 2. Präparieren und Befestigungsgewebesegmente <ol><li> Mit einem Skalpell geschnitten etwa 6 kleine Gewebesegmente (2 mm 2) aus dem distalen Kolon. Tun Sie dies auf einem Blatt of Dentalwachs und in einigen Tropfen PBS eingetaucht. </li><li> Post-fix die Gewebesegmente in Fixierungslösung für 3 h bei 4 ° C. </li></ol> 3. Micro-Sezieren Gewebeblöcke <ol><li> Bereiten Sie 5% niedrig schmelzenden Agarose in PBS und halten Sie sie in einem Wasserbad bei 45 ° C. </li><li> Die Gewebesegmente einbetten in 5% niedrig schmelzende Agarose mit einem kleinen Kunststoffbehälter, wie die Standard-Größe Tissue-Tek Cryomold. </li><li> Montieren Sie die eingebetteten Abschnitte auf einer vibrierenden Klinge Mikrotom und füllen Sie die Pufferwanne mit eiskaltem PBS. </li><li> Cut 300 um Gewebestreifen bei 0,8 Amplitude und 0,04 mm / s Geschwindigkeit. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt werden die Gewebestreifen aus der Agarose verdrängt werden. </li><li> Re-Einbettung 300 um Gewebestreifen in Agarose und montieren sie am Mikrotom senkrecht zur Vibratom Klinge. </li><li> Mit einem Vibratom geschnitten Gewebestreifen in einer Dicke von 50 um. Hinweis: Die endgültige Gewebeblöcke sollten etwa 300 &amp; mgr; m breit x 50 &amp; mgr; m dick sein. Diese dbmessungen von Pilot konfokalen Experimente, die zeigten, dass die Dicke der enteroendokrinen Zelle zwischen 15-20 um und die neuropod der Länge von 30 bis 70 nm optimiert. Daher könnte eine gesamte Zelle in einem Gewebeblock 300 um Breite und 50 um Dicke enthalten sein, wenn die Ausrichtung der Zelle parallel zu der Fläche der Gewebeblock ist. Variieren diese Dimensionen je nach Gewebe und Zelltyp von Interesse. </li><li> Die Gewebeblöcke in PBS bei 4 ° C. </li></ol> 4. Die konfokale Imaging <ol><li> Bereiten Sie eine Kernfärbung DAPI-Lösung durch Verdünnung in PBS bei 1: 4.000. </li><li> Inkubieren Gewebeblöcke in DAPI Kernfärbung für 5 min. Anmerkung: DAPI-Färbung erleichtert Scheidungs ​​einzelnen Zellen durch ihre Kerne, die hilfreich zum Korrelieren der konfokale SBEM Bildern ist. </li><li> Berg Gewebeblöcke auf geladene Objektträger aus Glas, ein paar Tropfen von PBS, und decken Sie sie mit einem Deckglas. </li><li> Mit einem konfokalen Mikroskop identifizieren Blocks mit intakter Villi und PyyGFP Zellen von Interesse und bebildert sie z-Stacks optische Schnitte zu erhalten. <ol><li> Verwenden Sie eine 20-fach / 0,8 Zeiss Plan Apochromat Ziel, z-Stacks von 1 um optische Schnitte zu erhalten. </li><li> Zur Z-Stapel, verwenden die Kanäle für 405 nm (DAPI), um die Beziehung zu anderen Zellen zu bestimmen, auf 488 nm endogenen GFP die Zelle von Interesse zu lokalisieren, und die Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) an Stelle der Zelle in Bezug auf die Bestimmung Lumen. </li><li> Verwenden Sie Bildauflösung von 1024 Pixel oder höher. </li></ol></li></ol> 5. Embedding Blocks in Agarose <ol><li> Herstellung von 10 ml Fixiermittel, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in PBS. </li><li> Die Gewebeblöcke vom Glas-Objektträger zu entfernen durch vorsichtige Zugabe von PBS in den Kanten des Deckglases an das Deckglas ohne Beschädigung der Gewebeblock aus dem Glasträger zu gleiten. Verwenden Sie dann eine schöne Kunstmalerpinsel, um das Gewebe Block von der Folie, um eine 1 übertragen0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd Fixativ. </li><li> Post-fix Gewebeblöcke O / N bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Gewebeblöcke auf PBS. Dann einbetten Blöcke flach in 5% niedrig schmelzende Agarose durch sandwich sie zwischen zwei Glasobjektträger. Hinweis: Einbetten der Blöcke in einer dünnen Schicht von Agarose erleichtert posterior Manipulation während der Färbung. </li><li> Schneiden Sie die Agarose in einem Quadrat und eine Kerbe auf der oberen Seite. Anmerkung: Dieser Schritt ist notwendig, um die Ausrichtung in den folgenden Schritten erhalten. </li><li> Speicher Blöcke in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li></ol> Serienblock Gesicht Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) In diesem Abschnitt wird die Gewebeblock hergestellt und mit SBEM abgebildet bei niedriger Vergrößerung. Das Übersichtsbild der Blockfläche wird dann mit den konfokalen Daten korreliert, um die Region, die die Zelle von Interesse zu identifizieren. Sobald die Regionidentifiziert ist, wird das Gewebe bei einer Auflösung von 7 nm / Pixel und Scheiben von 70 nm abgebildet. Dies war ausreichend, um zu beheben und zu unterscheiden groß dichten Kern sekretorischen Vesikeln aus anderen Organellen. In enteroendokrinen Zellen variiert diese Art von Vesikel zwischen 100 und 150 nm im Durchmesser, 13. Das Protokoll ist wie folgt: 6. Färbung Gewebeschnitten <ol><li> Entfernen Gewebe aus PBS und spülen dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer. </li><li> Fleckenblöcke für 1 h in 0,1% Gerbsäure in 0,1 M Cacodylat-Puffer gelöst, um den Kontrast von Zellmembranen 14 verbessern. </li><li> Führen Sie nachfolgende Färbung und Austrocknung von Gewebe nach dem veröffentlichten Protokoll 11. Folgende Deerinck et al. Protokoll, bereiten diese Lösungen: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) führen Aspartat-Lösung; 3) 1% Uranylacetat und 4) osmium tetraoxyde / Kaliumferrocyanid (OsO 4 / K Ferrocyanide). Mischen Sie 4% OsO 4 und 2xK Ferrocyanide stock [0,3 g K Ferrocyanide und 0,86 g Na Cacodylat in 10 ml H 2 O] im Verhältnis 1: 1 OsO 4 / K Ferrocyanide zu machen. Hinweis: Nachdem die in Agarose eingebetteten Gewebe erleichtert die Handhabung während der Färbung. Agarose für nachfolgende Harzinfiltration vorsichtig entfernen. </li><li> Spülen Proben dreimal jeweils 5 Minuten in 0,1 M Cacodylatpuffer und dann Fleck mit OsO4 / K-Ferrocyanid Lösung für 2 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min, und Fleck mit TCH für 30 min bei 60 ° C. </li><li> Spülen in Reinstwasser dreimal, jeweils 5 min und Fleck mit 2% OsO 4 (kein Ferrocyanid K) für 60 min bei RT. Wieder spülen in ultrareinem Wasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Fleck mit 1% Uranylacetat O / N bei 4 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Fleck mit Blei Aspartat für 30 min bei 60 ° C. Spülen in Reinstwasser dreimal mit je 5 min. </li><li> Dehydratisieren Gewebe durch Spülen in solutions mit steigenden Konzentrationen von Ethanol. Spülen 2 mal jeweils 5 Minuten mit 50%, 75%, 85%, 95% und 100% absoluten Ethanol. Am Ende gründlich Abschnitte mit Propylenoxid zweimal, jeweils 10 Minuten. </li></ol> 7. Als Spion and Embedding Gewebeschnitte in Resin <ol><li> Infiltrieren, die Blöcke mit Harz unter Verwendung der kommerziell avaialble kit. Betten Sie Gewebe in Harz mit einem EPON Einbettung kit. Vorbereitung einer Harzmischung aus 48% Epoxid, 20% ml DDSA, 30% NMA ml und 2% DMP30. Agitieren Harzgemisch 5 min kräftig und legen Sie dann mix im Vakuum für 30 Minuten, damit Luftblasen an die Oberfläche zu kommen. </li><li> Mischen Sie Harz mit Propylenoxid bei 1: 1-Verhältnis und kräftig schütteln. Entfernen Sie die endgültige Austrocknung Spülen von Geweben und fügen Harz vermischt mit Propylenoxid. Platz Fläschchen mit Proben in einem Rotator O / N und lassen Fläschchen nicht begrenzten. Am nächsten Tag, fügen Sie frisch zubereitete EPON-Harz und Mischen für 90 min in Rotator. </li><li> Betten Sie Blöcke in Harz so flach wie möglich durch Einfügen sie inzwischen Glasobjektträgern, die mit flüssigem Trennmittel ausgehärtet sind, um sie von aneinander kleben 15 verhindern. </li><li> Sobald die Blöcke Flach eingebettet, heilen die Bausteine ​​für eine zusätzlich 48 Stunden bei 60 ° C. </li><li> Ziehen Sie gleitet auseinander, um die Blöcke zu lösen. </li></ol> 8. Montage und Trimmen des Tissue-Block für Imaging <ol><li> Unter einem Binokular, passen Sie die Ausrichtung der Gewebeblöcke in Harz mit dem der konfokalen mikroskopischen Aufnahmen eingebettet, um zu erleichtern die Identifizierung der Bereiche, die Zellen von Interesse enthält vor dem Trimmen den Block. </li><li> Schneiden Sie das Harz eingebettet Block manuell bis zu einer ~ 500 x 500 &amp; mgr; m-Block-face. </li><li> Montieren Sie den Block flach auf einem Stift, die leitfähige Epoxidharz und trocken für 30 Minuten. Dann lag der Block flach auf einer Oberfläche und trocken O / N bei 60 ° C. </li><li> Mantel der Block mit kolloidalem Silber Flüssigkeit. Pflegen Sie die Gewebeschnitte flach Schneiden des Blocks in einem rechten Winkel zu gewährleisten, um die Zusammenarbeit zu erleichtern,rrelating die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Bild der Block mit einem Rasterelektronenmikroskop ausgestattet mit einem SBEM System (z .B., 3View). </li><li> Set Ausgangsdicke Schnitt bei ~ 2 &amp; mgr; m-Schritten und schneiden, bis das Gesicht des Gewebes ergibt sich aus dem Block. </li><li> Erwerben Sie eine Surver Bild des gesamten Block Gesicht. </li><li> Verwendung Fiji Software, Messungen sowohl die Serienblock-face und konfokale Mikroaufnahmen, einen gemeinsamen Nenner und machen Musterkettenschär während Fixierung und Färbung 16 zu erzeugen. </li><li> Suchen Sie den Bereich von Interesse auf der Blockfläche durch Multiplikation der Nenner auf die Koordinaten in den konfokalen Bildern. Verwenden auch andere strukturelle Merkmale, wie die Position der Mikrovilli, Becherzellen oder der Lamina propria als Referenz. </li><li> Bild Region von Interesse in eine 2,25 kV und 7 nm / Pixel (oder 15,147X Vergrößerung) in Hochvakuum-Modus. Slice-Schritten festgelegt werden solltenbei 70 nm oder weniger. </li><li> Sammeln SBEM-Daten im 16-Bit-.dm3 Format. </li></ol> 10. Optimieren SBEM Images für Oberflächensegmentierung <ol><li> Konvertieren SBEM Bilder von rohen .dm3 Format in 8-Bit-TIFF. </li><li> TIFF Filtern von Bildern mit einem 0,8 Gaußsche Unschärfe-Filter in Fidschi. </li><li> Verkleinern Sie die Daten auf 25% der Originalgröße festgelegt und speichern Sie sie als TIFF-Stapel, die Menge an RAM-Speicher erforderlich, um den Satz zu behandeln minimieren. </li><li> Richten Sie den Stapel SBEM Bilder mit der Fidschi-Plugin &quot;linear Stapel Ausrichtung mit SIFT&quot; im Übersetzungsmodus und beschnitten mit der &quot;Ernte 3D&quot; Plugin. Hinweis: Cropping hilft, die Menge an RAM-Speicher erforderlich weiter verringert für die Segmentierung und Volume-Rendering. </li></ol> Daten Rendering in 3D 11. konfokale Mikroskopie <ol><li> Rekonstruieren z-Stapel mit der automatische treffen Modus des &quot;Oberflächen&quot; Werkzeug. 1D zeigt eine reconstruction jedes Kanals mit Hilfe der glatten Option, die Oberflächen-Bereich Detail auf 0,126 &amp; mgr; m und Schwellen als absolute Intensität. </li></ol> 12. Serienblock Gesicht SEM Hinweis: Die manuelle Datensegmentierung ist ein sehr zeitaufwändiges Verfahren und in Abhängigkeit von den Merkmalen, das Verfahren kann mehrere Wochen dauern gerendert werden. Die Segmentierung für die Videos und Figuren in Bohórquez et al. 2014 8 wurde manuell durchgeführt und dauerte etwa 500 Stunden der Arbeit. Es wird empfohlen, die wesentlichen Merkmale benötigen Rendering vor Beginn der Segmentierungsprozess zu priorisieren. Die Vorgehensweise ist wie folgt: <ol><li> Verwenden Sie die &quot;Oberflächen&quot; Werkzeug in Zeichenmodus und die &quot;Kontur&quot; -Option im Zeichenmodus von 50 ms bis Segment manuell und Volumen machte die Zelle von Interesse. </li><li> Spuren Konturen auf jede Scheibe der Zelle für glattere Rendering oder alle 5 Scheiben für schnelleres Rendering. </li><li> Export im FinaleAlter mit Hilfe der &quot;Schnappschuss&quot; Werkzeug bei einer Auflösung von 300 dpi oder mehr. </li></ol>

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Dr. Satish Medicetty ist Mitarbeiter von und erhält 100% Gehalt von Renovo Neural Inc; Allerdings bedeutet dies nicht des Autors Einhaltung JoVE Politik ändern auf den Austausch von Daten und Materialien. Kein Interessenkonflikt ist für Rest Autoren erklärt.

<html> Magen-Darm-Chemosensorik wird als ein aufregendes neues Gebiet in der biomedizinischen Forschung entstehen. Dies ist zum großen Teil aufgrund der Entdeckung der funktionellen Geschmacksrezeptoren in enteroendokrinen Zellen 18. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass enteroendokrinen Zellen exprimieren Rezeptoren für bestimmte Nährstoffe, einschließlich Kohlenhydraten, Lipiden und Aminosäuren 5,6,19,20. Die katalytische Faktor für diesen Entdeckungen wurde die Entwicklung von Reporter Mäusen, bei denen enteroendokrinen Zellen fluoreszierend markiert 20. Wir entwickelten eine dieser Mäuse, die PyyGFP Maus, um enteroendokrinen Zellen des distalen Dünndarm und Dickdarm 17,21 studieren. Diese Zellen sind von Interesse, weil sie PYY und Glucagon-like Peptid 1, wobei beide Induktoren Sättigungs 22,23 absondern. Zu der Zeit, eine komplette Ultrastruktur Konto dieser Zellen fehlte, die wir glaubten, war notwendig, um die Signalmechanismen zu verstehen. NHALT &quot;&gt; Hier haben wir beschrieben, eine optisch ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie mit SBEM überbrücken. Die Methode wird als Cocem3D, die uns um die komplette Ultrastruktur von Zellen enteroendokrinen dokumentieren. Wir haben berichtet, dass diese Zellen eine neuropod, die drei- enthält zugelassen bezeichnet Viertel aller sekretorischen Vesikeln 8. Im neuropod gibt Neurofilamente und ähnlich wie neuronale Axone werden neuropods durch Darm Gliazellen 8 gefördert. Noch wichtiger ist es, obwohl diese neuropods das Zellen enteroendokrinen physische Verbindungen mit Neuronen innerviert den Darm und Doppelpunkt 9. Eine der Stärken der cocem3D ist seine Einfachheit. Verringern der Gewebeprobe in einen Block, der durch konfokale abgebildet werden kann und SBEM erleichtert die Identifizierung einer bestimmten Zelle in einem Gewebe. Sekretorischen Vesikeln und anderen Organellen mit Leichtigkeit bei einer Auflösung von 7 nm / Pixel identifiziert werden. Da die Abschnitte in SBEM werden verworfen, weitere processingen von Geweben, um spezifische Proteine ​​zu identifizieren ist keine Option an dieser Stelle. Jedoch ist die Entwicklung von Methoden wie ATUM 24, wobei Abschnitte von dem Gewebe-Block erhalten werden, geeignet sind, die Identifizierung von spezifischen Proteinen in der Zelle zu ermöglichen. Bestimmung der spezifischen Lage der chemosensorische Rezeptoren auf enteroendokrinen Zellen wesentliche Informationen für die Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Übergewicht, weil enteroendokrinen Zellen sind eine sensorische Schnittstelle zwischen Nahrung im Darm und das Sättigungsgefühl im Gehirn.

Das Leben in einer Zelle stattfindet, in Zeit und Raum. Veränderungen über die Zeit oft mit Zeitraffer-Mikroskopie eine bildgebende Verfahren, wie Super-Resolution-Mikroskopie untersucht. Raum, insbesondere die Anordnung von Organellen innerhalb einer Zelle oder Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, kann nur durch eine vollständige Darstellung der Feinstruktur der Zelle abgeleitet werden. Eine umfassende Darstellung der Feinstruktur einer Zelle kann auch Klarheit, um genomische Funktion bringen in Fällen, in denen das Genom vorhanden ist, wie die C. elegans Nematoden-1 oder die flache Placozoa tricoplax adherens 2. Serienschnittelektronenmikroskopie ist nun eine reproduzierbare, zeiteffizient und weniger kostspielige Aufgabe dank der Entwicklung von automatischen 3D Elektronenmikroskopie Technologien wie serielle Block-face Rasterelektronenmikroskop 3 (SBEM). Der Bedarf an Strukturinformationen zur Funktion aufzuklären ist sehr offensichtlich in bestimmten cell Typen, bei denen Funktion hängt von physikalischen Zellen-Zellen-Wechselwirkungen, wie Neuronen, Gliazellen oder sensorischen Epithelzellen. Wir sind besonders daran interessiert, bei der Aufklärung, wie sensorische Signale von Nährstoffen in das Lumen des Darms werden in ein elektrisches Signal, das letztlich moduliert appetitive Verhaltensweisen transduziert. Der Schaltkreis ist komplex, aber beginnt an der Darmwand, wo Nährstoffe in Kontakt mit sensorischen Epithelzellen, genannt enteroendokrinen Zellen kommen. Im Gegensatz zu anderen sensorischen Epithelzellen, wie Geschmackszellen werden enteroendokrinen Zellen im ganzen Darmepithel in einem Verhältnis von eins bis eintausend 4-7 dispergiert. Folglich waren sie schwer zu identifizieren und zu untersuchen, und für lange Zeit wurden sie nur als eine Quelle von Darmhormone angesehen. Aber mit der Entwicklung zellspezifischer Fluoreszenzreportermäusen, die komplexe sensorische Funktion dieser Zellen entsteht. Mit einer der folgenden Reporter Mäusen ein Peptid YY-GFP (PyyGFP) Maus, fanden wir, dass enteroendocrine Zellen eine herausragende cytoplasmatischen Schwanz, die wir mit dem Namen neuropod. Das Aussehen der neuropods vorgeschlagen eine konservierte Funktion von Zelle-zu-Zell-Kommunikation. Somit begründet, daß wir durch die Dokumentation der Ultrastruktur eine enteroendokrine Zelle, deren Funktion neuropods abgeleitet werden konnte. Die Notwendigkeit, die Struktur von einem Fortsatz in einer Zelle verteilt, die schwer zu erkennen, ist zu verstehen war der Hauptgrund für die Entwicklung eines Verfahrens zur konfokalen Mikroskopie und SBEM kombinieren. Die Zelle von Interesse wurde mit PyyGFP enteroendokrinen zellspezifische Reporter Mäusen identifiziert. Das Verfahren erlaubt es uns, die gesamte Ultra eines enteroendokrine Zelle und ihrer neuropod dokumentieren. Innerhalb neuropods fanden wir strukturellen Merkmale neuronalen Axonen und außerhalb neuropods, fanden wir eine physikalische Beziehung zu ente Glia 8. Tatsächlich enthalten neuropods etwa 70% aller sekretorischen Vesikeln vermutlich eine wesentliche Rolle bei der sekretorischen Funktion dieser Zellen. Aufbauend auf dieStrukturdaten, in jüngerer Zeit fanden wir, dass durch diese neuropods, enteroendokrinen Zellen und Neuronen innerviert den Darm bilden eine neuroepitheliale Schaltung, ähnlich der von Geschmackszellen in der Zunge 8,9. Aufdeckung solcher Merkmale von Magen-Darm chemosensory Mechanismen ergab sich aus Strukturdaten gesammelt mit diesen korrelative Mikroskopie-Methode. Wir glauben, dass diese Methode auch in anderen Gebieten der Zellbiologie, der besonders bei der Zellen im Gewebe zu einem sehr geringen Verhältnis verteilt werden. Wir bezogen auf die Verfahren nach Korrelat konfokalen und Serienblockfläche Rasterelektronenmikroskopie in 3D (Cocem3D). Das Verfahren besteht aus den folgenden Hauptschritte umfasst: Gewebedissektion, Konfokalmikroskopie SBEM Bildgebung SBEM und konfokaler Bildkorrelation und manuelle Segmentierung. Im Vergleich zu anderen korrelative Verfahren ist das Konzept nicht einfach, weil die Korrelation physikalischen anstatt Chemikalie.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%, freshly made in PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp; nuclear stain</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Postively charged glass slides and coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine art paintbrush #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812 kit&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid releasing agent&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Liquid silver colloidal&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks conductive epoxy&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow peristaltic pump</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view system</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo provides 3d EM services</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Open access software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer station with 16 GB of RAM or more</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data visualization software Imaris 7.5&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Abgrenzung der Ultrastruktur der Zelle ist für das Verständnis der Funktion. Dies kann eine schwierige Projekt für seltene Zelltypen im ganzen Gewebe der verschiedenen Zelltypen, wie enteroendokrinen Zellen des Darmepithels gemacht diffundieren. Diese gastrointestinalen Sensoren von Lebensmitteln und Bakterien waren schwierig zu untersuchen, da sie unter anderen epithelialen Zellen in einem Verhältnis von 1 dispergiert sind: 1,000. Kürzlich transgene Reportermäusen erzeugt wurden, um Zellen zu identifizieren enteroendokrinen mittels Fluoreszenz. Eines davon ist das Peptid YY-GFP-Maus. Mit dieser Maus, ein Verfahren zur konfokalen und Serienblock-face Rasterelektronenmikroskopie korrelieren entwickelten wir. Wir nannten das Verfahren cocem3D und wendete sie auf eine bestimmte enteroendokrinen Zelle im Gewebe erkennen und zu enthüllen, Ultrastruktur der Zelle in 3D. Die Auflösung cocem3D ist ausreichend, um Organellen für Volumenwieder identifizieren so klein wie sekretorischen Vesikeln und zu unterscheiden, Zellmembranenndering. Cocem3D leicht angepasst, um die 3D-Ultrastruktur von anderen spezifischen Zelltypen in ihrer Muttergewebe zu untersuchen.

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um die Ultrastruktur von einer bestimmten Zelle innerhalb einer Epithelschicht studieren. Die Zelle von Interesse ist in diesem Fall das schwer fassbare enteroendokrinen Zelle. Ihre Identifikation in situ wurde erst in den letzten Jahren mit der Entwicklung von zellspezifischen Fluoreszenzreportermäusen möglich. Im Jahr 2011, haben wir eine Maus, bei der der Promotor des Hormons PYY treibt die Expression des grün fluoreszierenden Proteins 17. In diesem PyyGFP Maus werden enteroendokrinen Zellen des distalen Teils des Dünndarms und des Dickdarms leicht unter UV-Licht aus. Das Maus-Modell war ein Grundstein, um einen Gewebeblock, die ein enteroendokrinen Zelle erkennen und verarbeiten es für SBEM. Das Korrelationsverfahren wird hier als cocem3D bezogen und auf der zuvor veröffentlichten Protokollen 10,11 aufgebaut. Optimierung der Abmessungen der Gewebeblocks ist kritisch für die Korrelation. In Vorversuchenes wurde festgestellt, dass in einem Gewebeblock 300 &amp; mgr; m lang x 50 um dick die Anzahl der SBEM Bilder wird auf ein Minimum reduziert, während die den gesamten Körper der Zelle von Interesse. 1A zeigt einen Overlook der Dissektion mit einem Schwingklinge microtrome zu erhalten die Gewebeblock mit den richtigen Abmessungen. Mindestens 100 Blöcke werden vor dem Sortieren durch sie an Menschen mit intakten Zellen von Interesse holen erhalten. Ausgewählten Blöcke durch konfokale Mikroskopie und Bild z-Stapel abgebildet werden optisch beabstandet jeden 1 &amp; mgr; m (1B und C). 1D zeigt eine volumenwiederAnsicht einer enteroendokrine Zelle im Ileum der Maus. Seine herausragende neuropod sich unterhalb Epithelzellen für ~ 60 &amp; mgr; m. Die Zelle von Interesse wird durch Korrelation der konfokalen z-Stacks mit einer SBEM Bild des gesamten Blockfläche gefunden. Ein Beispiel ist hier aus einem Block aus dem distalen Kolon eines PyyGFP vorgestelltMaus. Nach Erhalten konfokalen Z-Stapel (2A), wird der Block in einer dünnen Schicht von Agarose mit niedrigem Schmelz (2B) eingebettet. Dies ist für die nachfolgende Bearbeitung des Blocks erforderlich. Es ist wichtig, die Ausrichtung des Blocks so flach wie möglich, um die optischen Scheiben mit den Scheiben SBEM übereinstimmen aufrechtzuerhalten. In 2C wird ein repräsentatives Bild von der gesamten Fläche der Gewebeblock gezeigt. Teile dieser Figur wurden zuvor in Bohorquez et al., 2014 8. Dieses wurde anschließend mit dem konfokalen Bild unter Berücksichtigung Teilpunkte und Maße korreliert. 2D zeigt eine Überlagerung der konfokalen und SBEM Bild des Blocks und enthüllt die genaue Lage unserer Zelle von Interesse. Sobald die Zelle identifiziert wurde, wird SBEM Bildgebung bei einer Auflösung hoch genug, um sekretorischen Vesikeln und anderen Zellorganellen zu identifizieren getan. Der Datensatz präsentierte erre wurde bei 7 nm pro Pixel abgebildet wird, wie Bilder des Blocks wurden alle 70 nm gemacht. Der Datensatz enthält 643 Bilder, 45 um der Gewebetiefe erstrecken. Wenige Mikrometer sind während der anfänglichen Bilderzeugung der gesamten Blockfläche bei geringer Vergrößerung rasiert. Die rohe SBEM Datensatz wurde in .dm3 Format erworben und TIFF für nachfolgende Handhabung umgewandelt. Die SBEM Stapel wurde mit der Fidschi Software-Plugin &quot;crop (3D)&quot; Block, nur den Bereich von Interesse enthalten, abgeschnitten. Dies reduziert die Menge an RAM-Speicher für Volumenberechnungen notwendig. Die Zelle wurde durch seine Position und sekretorischen Vesikeln identifiziert und segmentiert Verwendung Imaris Software, Fig. 3 enthält eine Wiedergabe in 3D des enteroendokrine Zelle. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Abb. 1: Correlative Konfokalmikroskopie (A) Arbeitsablauf, um ein Stück zu sezierenDarmgewebe in ein Gewebe Block 300 x 50 &amp; mgr; m dick. (B) Eine repräsentative Gewebeblock der richtigen Dimensionen. Man beachte, dass ein Gewebeblock dieser Dimensionen aus der Maus Dünndarm erstreckt sich über etwa 3 Zotten oder im Falle des Kolons etwa 8 Krypten. (C) Eine Zotten des Dünndarms, die eine Zelle von Interesse. (D) Ein konfokales Z-Stapel in 3D mit Imaris Software gerendert zeigt eine enteroendokrine Zelle mit einem prominenten neuropod unterhalb des Darmepithels läuft. Blau = DAPI Kernfärbung. Bars = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figur 2: Serienblockfläche Rasterelektronenmikroskopie (A) konfokale Bild Fischspeziali.cted Gewebeblock aus dem Dickdarm PyyGFP enteroendokrinen Zellen (grün) von Interesse enthält. (B) Wenn der Block durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, es wird dann flach in niedrig schmelzenden Agarose unter Verwendung von Glasplättchen eingebettet. Einbetten der Gewebeblock in Agarose erleichtert anschließende Manipulation und die Kerbe in der linken Ecke hilft, den Block innerhalb des SBEM in der richtigen Orientierung zu montieren. (C) SBEM Bild des Gesichts des Blocks. (D) Korrelation der Daten mit konfokalen SBEM zu Zelle von Interesse (weißer Pfeil) zu identifizieren. Bilder c und d der Figur sind aus Bohorquez et al. Modifiziert 2014 8. Blau = DAPI Kernfärbung. Bars = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Abb. 3: Die Daten in 3D-Rendering (A) Volume-Rendering enteroendokrinen Zelle mit Imaris Software. Die Zelle enthält eine neuropod mit sekretorischen Vesikeln verpackt. Für eine vollständige Beschreibung der Ultrastruktur einer Zelle enteroendokrinen Sie bitte Bohórquez et al., 2014 8 beziehen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Serie: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Forschung

Biotechnik

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Entwicklungsbiologie

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Neurowissenschaften

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Biologie

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Immunologie und Infektion

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for structural analysis, light microscopy is essential for the visualization of dynamic organelles by target-specific labeling. The following protocol describes a method that combines dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) to observe the interactions between mitochondria and lysosomes. In this study, mitochondria were labeled with mEosEM (Mito-mEosEM) and lysosomes with TMEM192-V5-APEX2. The results obtained from CLEM images enable us to observe the changes in the interactions between mitochondria and lysosomes under external stress conditions. Treatment with bafilomycin (BFA), which inhibits lysosomal function, resulted in an increase in contact between mitochondria and lysosomes, leading to the formation of fragmented mitochondria trapped inside lysosomes. Conversely, treatment with U18666A, which inhibits cholesterol export from lysosomes, caused lysosomes to be surrounded by mitochondria, indicating a distinct form of interaction. This study presents an effective method for observing the interactions between mitochondria and lysosomes in fixed cells. Furthermore, CLEM imaging with dual-color probes offers a powerful tool for future investigations of organelle dynamics and their implications for cell function and pathology.

This protocol describes a mechanism for using correlative light and electron microscopy to visualize the interaction of mitochondria and lysosomes labeled with mEosEM and APEX2, respectively.

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...