The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von Großbritannien Home Office und der Universität von Edinburgh Veterinary Services eingestellt geführt. 1. Infektion der Mäuse durch Gavage <ol><li> Shop Heligmosomoides polygyrus L3-Larven in destilliertem Wasser für bis zu sechs Monate bei 4 ° C. </li><li> Vor Gebrauch waschen L3-Larven dreimal in destilliertem Wasser: Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten (mit Bremse), entfernen Sie alle, aber 500 ul Wasser (um störende pelletiert L3-Larven zu vermeiden) und das Pellet jedes Mal. </li><li> Bei dem dritten Waschen, Wasser hinzufügen, um eine genaue Volumen (in der Regel 40 ml) und saugen Sie 20 ul mit 200 ul Spitze geschnitten, um ihre Öffnung zu erweitern. Platzieren zwei 20-ul-Proben auf der Oberfläche einer 60 mm Kulturschale und zählen die L3-Larven (üblicherweise mobil und am besten unter 50-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop betrachtet). Resuspendieren endgültige Pellet in destilliertem Wasser auf ein concentration von 2.000 L3 Larven pro ml. </li><li> Für Lebenszyklus Produktion, infizieren 8 Wochen alte F1 (C57BL / 6xCBA) Mäuse mit 400 H. polygyrus L3-Larven in 200 ul destilliertem Wasser durch orale Gabe (zurückhalten Mäuse in aufrechter Position durch das Genick des Halses und sanft passieren die stumpfe Sondennadel durch den Mund und Speiseröhre in den Magen). Gut geschüttelt, vor jeder Infektion (Larven begleichen schnell in Wasser) und saugen Sie 200 ul in einer 1 ml Spritze; einen dedizierten Sondennadel mit einem abgerundeten Ende. Für experimentelle Infektion von jüngeren Mäuse (6-8 Wochen alt) oder anderen Inzuchtstämme (z C57BL / 6 oder BALBc) infizieren Mäuse mit 200 L3 Larven. </li></ol> 2. Vermehrung und Pflege von H. polygyrus <ol><li> Zeigen Kohle in der Mitte eines großen Kunststoffwanne und lassen kaltes Leitungswasser, um über sie für mindestens 30 Minuten laufen (ungewaschen Aktivkohle ist giftig für L3-Larven). Lassen Sie das Wasser aus der Wanne und legen Sie die Holzkohle auf two saugfähiges Papier legen, so dass es bis zur vollständigen Trocknung der Raumluft ausgesetzt. </li><li> Wenn Eier erforderlich sind, kratzen Kot zuerst aus dem Dickdarm mit einer Pinzette (und Schere falls erforderlich). Wenn eine große Anzahl von L3-Larven erforderlich ist, platzieren Mäuse auf einem Drahtgitter und sammeln Kotpillen über mehrere Tage. </li><li> Mischen Sie die Fäkalien mit granulierte Aktivkohle bei einem Verhältnis von mindestens 1: 1, um eine Konsistenz zu erreichen nur feucht genug, um sich an Filterpapier. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf der Mitte von etwas angefeuchteten Filterpapier in einer Petrischale und legen Sie diese in einer feuchten Box (fügen Sie einige feuchten Papiertuch und eine Schüssel mit Wasser) im Dunkeln für 12-14 Tage. </li><li> Entfernen L3-Larven von Tag 7 ab, und sammeln sie auf mindestens zwei Gelegenheiten, bevor das Papier wird verworfen. Die Larven bilden einen Ring rund um den Rand des Filterpapiers; Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die Larven, die der Platte gelassen werden (mit einer Pipette und 5 ml sterilem Wasser pro Platte) in einen 50-ml-Tube. </li><li> AufzugAus dem Filterpapier und ernten die restlichen Larven links auf der Platte mit destilliertem Wasser in einen 50-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die abfließende Lösung bei 300 g für 10 min. Dreimal Waschen Sie die Larven mit destilliertem Wasser und dann bei 4 ° C lagern in bis zu 50 ml destilliertem Wasser, bis sie benötigt. HINWEIS: Die Larven bleiben lebensfähig und infektiös für mindestens 6 Monate. </li></ol> 3. Sammlung von Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereiten Sie die modifizierten Baermann Apparat im Voraus, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Cull Mäusen 14 Tage nach der Infektion. </li><li> Den Unterleib mit 70% Ethanol waschen. Schneiden Sie die Haut über den Bauch und ziehen Sie, um die vordere Bauchwand zu offenbaren. Stellen Sie Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Nehmen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm (Duodenum von proximal nach distal Rektum). Zeigen in eine trockene Petrischale. </li><li> Richten Sie den Darm über ihre gesamte Länge; Verbrauchsteuern die Fäkalien haltige Dick; legen Sie diese in eine separate Schüssel für Eierzubereitungen später. </li><li> Zuschneiden die proximalen 20 cm des Dünndarms, die die adulten Würmer von der relativ dicken Wand des Duodenums und oft eine rote Erscheinungsbild -identified aufgrund der intraluminalen Würmer enthält. In eine (Durchmesser 100 mm) Petrischale mit 5 ml Hanks-Lösung, erwärmt auf 37 ° C (zwei Exemplare pro Schale). </li><li> Öffnen Sie den Wurm-gefüllte proximalen Darmteil in Längsrichtung mit einer Schere (rund digen Schere sind am besten für diese), und kratzen im Inneren der Darmschleimhaut mit zwei Glasobjektträger um die Würmer zu entfernen. Dann werfen Sie die saubere Darmwand. </li><li> Tipp Würmer in kleine Musselin Taschen, Klammer geschlossen und mit Büroklammern um den Rand des Glastrichters (Abbildung 1). </li><li> Füllen Trichter mit Hanks-Lösung, geben Sie ca. 4 Petrischalen von Würmern in jeden Trichter. </li><li> Platz Gerät in 37 ° C-Inkubator für 1-2 h, Rühren sanft auf halbem Weg durch, um zu verdrängenSchmutz aus dem Darm Vorbereitung, die den Musselin Filter verstopfen können. Achten Sie darauf, um das Auslaufen von Schutt außerhalb des Musselinbeutel zu vermeiden - das wird eine Verunreinigung des letzten HES Vorbereitung verursachen. Erwachsene Würmer sollten langsam durch das Baumwolltuch migriert und an der Unterseite des Glasteströhrchen angesiedelt haben. Entfernen Sie vorsichtig das Reagenzglas aus dem Verbindungsgummischlauch über dem Waschbecken (dabei darauf achten, nicht zu verlieren Würmer an dieser Stelle). </li><li> Mit einem Kunststoff Pipette die Würmer in einen 50-ml-Tube und waschen sechsmal mit Hanks-Lösung (erlauben Würmer mit der Schwerkraft mit einer Stripette niederzulassen, zu entfernen Medien, 40 ml Hanks-Lösung, und wiederholen Sie fünf Mal). HINWEIS: Wurm Kultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. <ol><li> Gehen Sie zu einer Steril und waschen weitere sechs Mal in steriler Hanks-Lösung mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, bereit für die in-vitro-Kultur ergänzt. </li></ol></li><li> Zählen Sie dieerwachsenen Würmer, indem man zwei Proben von 20 ul mit einer gelben Spitze cut ergriffen, um ihre Öffnung zu erweitern erholt; erwarten, etwa 50% der Menge des inokulierten Larven. </li></ol> 4. Einrichten Kulturen für HES: Medium Vorbereitung, Waschen Erwachsene Worms <ol><li> Weichen die Würmer von 3,11 in etwa 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% Gentamycin für 20 Minuten, so dass die Röhre ruht in einem Winkel, um sicherzustellen, Würmern vollständig abgedeckt werden. </li><li> Führen Sie diese in einer Steril: nachwaschen sechsmal mit Hanks-Lösung (ergänzt mit 5 U / ml Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin). </li><li> Bereiten H. polygrus Medien. </li><li> Die Aufrechterhaltung der Sterilität in einem Abzug mit laminarer Strömung, um 500 ml des RPMI1640 Fügen 11,1 ml 45% Glukose (Endkonzentration 1,2% RPMI1640 enthält 0,2% Glucose), 5 ml 100x Peniclllin-Streptomycin (Endkonzentration 5 U / ml Penicillin, 5 &amp; ​​mgr; g / ml Streptomycin) versetzt, 5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), und5 ml Gentamycin (Endkonzentration 1%). Sie FCS hinzufügen nicht. </li><li> Aliquoten Würmer in entlüftet T25-Kolben, ca. 1.000 Würmer in 15 ml H. polygyrus Medien pro Kolben und Ort aufrecht in 37 ° C-Inkubator (5% CO 2) für 3 Wochen. </li></ol> 5. Herstellung von HES <ol><li> Sammeln HES haltigen Kulturmedien aus Kulturen in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche, die Aufhebung der ersten Kollektion nach 24 Stunden der Kultur (durch den hohen Grad der LPS Verschmutzung und Wirtsproteinen - getrennt verarbeitet oder verworfen werden). Halten Sie jede Sammlung getrennt und deutlich mit dem Datum und Chargennummer versehen. Ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von H. polygyrus Medium auf jeder Gelegenheit. </li><li> Zentrifuge HES haltigen Medien bei 400 x g für 5 min. Dann filtern sterilisieren durch 0,2 um niedrige Proteinbindung Filter in 50 ml Tuben. Shop in der -20 ° C Gefrierschrank deutlich mit Datum der Wurm Ernte und das Datum der HES c gekennzeichnetollektion. </li><li> Nach 21 Tagen der HES Sammlung von Kultur, verwerfen Würmer. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES Überstand (in der Regel aus der Tiefkühl, und nicht die, die die erste 24-Stunden-Sammlung) und einen 3.000 MWCO-Filter in der Ultrafiltrationsvorrichtung zu konzentrieren auf unter Stickstoffdruck. HINWEIS: Achten Sie sorgfältig darauf, den Filter trocken laufen lassen. <ol><li> So richten Sie das Filtergerät, zuerst die 3 kDa Membran glänzende Seite in einem 1-Liter-Becher sich gründlich mit destilliertem Wasser für 3 x 20 Minuten unter Rühren. Montieren Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung nach Angaben des Herstellers mit Filtermembran glänzenden Seite nach oben. Platz im Schrank bei 4 ° C erwärmt und 50 ml destilliertem Wasser durch, bevor Sie sich auf die Sammel HES konzentrieren. </li><li> Fügen jedes Rohr von HES in die Filtrationsvorrichtung nach Bedarf (100-140 ml pro Tag), bis das Volumen 2-5 ml eingeengt wird. </li></ol></li><li> Um Verunreinigungen von der HES-enthaltende Kulturmedien zu entfernen, 50 ml pyr hinzufügenogen freien PBS zu der Filtervorrichtung und dann konzentrieren sich auf ca. 2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (150 ml PBS insgesamt). Übertragen HES in einen 15-ml-Röhrchen, filtersterilisieren (mit einem 0,2-um-Filter) in einer Haube mit laminarer Strömung und Messen der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers (E 280 = 10) oder mit dem Bradford-Assay. </li><li> Aliquot, Label mit Chargennummer und das Datum und die Gefriert bei -80 ° C. </li><li> Führen eines chromogenen LAL Assay nach den Protokollen des Herstellers für jeden Ansatz durch HES vor der Verwendung. Wenn LPS Niveau von größer als 1 U LPS pro 1 ug Protein sind, sollten Sie nicht mit dieser Charge für in vivo-Experimenten oder in vitro-Kulturen. </li><li> Verarbeiten Sie die bei 24 Stunden getrennt in der gleichen Art und Weise gesammelt HES; es wird LPS und einige Wirtsproteine ​​enthalten und, obwohl sie nicht für verschiedene Experimente ist es eine nützliche Quelle von einzelnen Molekülen, die durch den monoklonalen Antikörper der Affinitätsreinigung isoliert werden kann. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Der Lebenszyklus von H. polygyrus Erlöse in einer konsistenten Art und Weise zuverlässig. Nach Natur Verschlucken oder orale Gabe von L3-Larven am Tag 0, beginnen Zysten unter der Zwölffingerdarm-Serosa von Tag 5 zu bilden, voran zu Larven Häutungen und Schwellenländern als erwachsenen Würmer in das Darmlumen von Tag 10, können Eier im Kot aus gesehen werden Tag 14 und Granulome auf der duodenalen Serosaoberfläche von Tag 21. Die oben beschriebenen (und in Figur 6 zusammengefaßt) -Protokoll sichtbar ermöglicht Produktion mit hohem Durchsatz von H. polygyrus Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES), zusätzlich zum zuverlässigen Wiederherstellung lebensfähiger L3-Larven für zukünftige experimentelle und Lebenszyklus-Infektionen. H. polygyrus Infektion hat sich gezeigt Schutz in Modellen von Asthma abhängig von OVA oder Der p 1 (Hausstaubmilben-Allergen) 14 sein. Darüber hinaus könnte die Unterdrückung der Atemwegsentzündung mit CD4 + CD25 + übertragen werden </sup&gt; regulatorischen T-Zellen 14 oder CD19 + CD23 hallo regulatorischen B-Zellen 24 aus nicht-sensibilisierten, H. polygyrus infizierten Mäusen. Bei den Modellen der Autoimmunität, H. polygyrus Infektion wurde gezeigt suppressive in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell von Multipler Sklerose 9 zu sein, und die Unterdrückung kann entweder mit CD4 + T-Zellen oder CD19 + B-Zellen aus infizierten Mäusen 24 übertragen werden. Heligmosomoides polygyrus Ausführungs sekretorischen Produkten (HES) modulieren die Immunantwort des Wirts und Th2-vermittelte Entzündung unterdrücken, indem eine Reihe von Mechanismen (in Abbildung 7 beschrieben), einschließlich: a) Hemmung der dendritischen Zellen gegenüber Stimulation 25, b) Induktion von CD4 + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen 18. und c) die Blockierung von IL-33 Produktion 20. HES hat sich gezeigt, schützend zu sein, wenn sie verabreicht eint Sensibilisierung oder Herausforderung in der OVA-Alaun-Modell von Asthma 19 und auch, wenn intranasal mit Alternaria Extrakt Allergen 20 verabreicht, durch Unterdrückung der frühen IL-33 Freisetzung. Vermeidung der LPS Kontamination von HES ist oft von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Zukunft immunologischen Experimenten. Im Protokoll hier skizzierten die kritischen Schritte bei der Erreichung dieses sind, dass innerhalb der Musselin Taschen der Baermann Gerät nicht in die endgültige HES Zubereitung enthaltenen Schmutz zu gewährleisten (siehe 2.10) und zur Seite zu ES-Lösung aus der ersten 24 Stunden der Kultur gesetzt (siehe 5.1). In den letzten Jahren HES wurde gründlich an der Proteom-Ebene mit mehr als 370 identifiziert 26,27 unterschiedliche Proteine ​​aus. Darüber hinaus hat ES aus dem 4. Larvenstadium zu Proteomanalyse 28 unterzogen. Laufende Arbeiten Charakterisierung der Hauptkomponenten von Glycan HES bekannte stark immunogen 3 zu sein, und sezernierten Mikro RNWie die in 50 bis 100 nm Bläschen oder Exosomen (Buck et al., Zur Publikation eingereicht) gekapselt. Mit der Gründung der reproduzierbaren Protokolle für die Sammlung von ES aus diesem hoch immunmodulatorische Parasiten und mit umfangreichen proteomische Daten zur Identifizierung der molekularen Komponenten von HES ist die Bühne nun für die Identifizierung und therapeutische Prüfung einzelner Moleküle aus H. eingestellt polygyrus die Schlüssel Auswirkungen auf das Immunsystem des Wirts zu vermitteln können.

Heligmosomoides polygyrus ist ein natürlicher Maus-Magen-Darm-Helminthen, die eng mit hoch vorherrschende menschliche Nematodparasiten 1 verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen Nematoden Modelle wie Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsequent stellt eine chronische Infektion in Mäusen als eine direkte Folge von mehreren leistungsstarken immunmodulatorische Mechanismen beschäftigt, um die Immunantwort des Wirts 2 zu unterdrücken. H. polygyrus hat einen direkten Lebenszyklus: infektiösen L3-Larven werden von feco-orale Übertragung aufgenommen (oder durch orale Gabe in der Laborumgebung verabreicht), worauf sie wandern zum subseröse Schicht des Zwölffingerdarms und encyst vor der Rückkehr in das Darmlumen als erwachsenen Würmer etwa acht Tage nach der ersten Infektion. Paarung und Eierproduktion tritt am Tag 10 und es ist möglich, adulte Würmer für Kultur und Sammlung von Ausscheidungs-sekretorischen Produkte da ernteny 14 ab 3. H. polygyrus interagiert auch mit der kommensalen Mikroflora, mit erhöhter Milchsäurebakterien vorhanden in infizierten Mäusen anfällig 4-6, und ein höheres Maß an H. polygyrus Infektion nach Exposition von Mäusen auf Laktobazillen 6. Aktive Infektion mit H. polygyrus wurde gezeigt, dass gegen Immunpathologie in vielen Tiermodellen für Autoimmunität 7-10 schützen, Colitis 11,12 und Allergien 13-16. Daher gab es großes Interesse an dem Potenzial der Ausscheidungs-Sekretorische Moleküle aus diesem Parasiten (&quot;HES&quot;), um nach unten zu modulieren Pathologie in vivo 17,18. Tatsächlich werden schützende Wirkung nach der Behandlung der Mäuse mit HES-Produkte 19 über Pfade, die jetzt identifiziert 18,20 ersichtlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die zuverlässige Herstellung von Heligmosomoides polygyrus und Wiederherstellung ihrer abgesondert Produktedaß weiter eine Reihe von funktionellen biochemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (früher Nematospiroides dubius bekannt und auch von einigen als H. bakeri bezeichnet) ist ein gastrointestinaler Helminthen, die mehrere immunmodulatorische Mechanismen einsetzt, um eine chronische Infektion in Mäusen herzustellen und ähnelt vorherrschenden menschlichen Wurminfektionen. H. polygyrus wurde ausgiebig auf dem Gebiet der Wurm abgeleitete Immunregulation studiert und hat sich als potent drücken experimentellen Modellen von Allergie und Autoimmunität (beide mit einer aktiven Infektion und isoliert abgesondert Produkte). Die in diesem Papier beschriebene Protokoll beschreibt Verwaltung des H. polygyrus Lebenszyklus für eine konsistente Produktion von L3-Larven, die Verwertung von erwachsenen Parasiten und Sammlung ihrer Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES).

Die Anfälligkeit für eine Infektion mit H. polygyrus wird zu einem großen Teil durch den genetischen Hintergrund der Mausstamm (Tabelle 1) gesteuert wird; C57BL / 6 und CBA-Mäusen sind sehr anfällig 21,22. Für die Versorgung der Lebenszyklus des Parasiten hat die F1-Hybride zwischen diesen beiden Stämmen für seine Fähigkeit, sehr viel höher Wurmlast ohne Morbidität (übermäßige Darmepithelzellen Schäden) zu widerstehen, verglichen mit entweder Elternstamm ausgewählt. Oralsonde 400 L3 Larven wird der Lebenszyklus in F1-Mäuse zu erhalten (was zu Erwachsenen in 2 gezeigt Wurmlast), während eine Dosis von 200 L3 Larven wird allgemein für Experimente bei homozygoten Inzuchtstämmen (beispielsweise C57BL / 6 verwendet oder BALBc). Allerdings müssen diese Dosierung kann je nach Umgebungs Cofaktoren, die zwischen Tierhaltung, wie Schwankungen der Darmflora unterscheiden können reduziert werden. Chargen von HES haben reproduzierbare effi bewährtsamkeit in funktionellen Assays und Protein-Zusammensetzung; Außerdem, wenn Überstände von jedem aufeinanderfolgenden Woche Kultur wurden analysiert, bis zu insgesamt 4 Wochen wurden die Proteinprofile gefunden, sehr ähnlich (Figur 3). Wenn HES Konzentration wird mittels Bradford-Test gemessen (siehe 5.5) werden die Gesamt Protein ist in der Regel etwa 1 mg / ml (Figur 4). Ein alternatives Verfahren zum Konzentrieren von HES mit einem Zentrifugenkonzentrator (zB Vivaspin 3 kDa cut-off Membran), in denen die Proben werden auf bis zu 4.000 g in einem Ausschwingrotor Zentrifuge, Entfernen Puffersalze und niedrigmolekulare Bestandteile. Kreisel Konzentration ist am besten für kleine Verarbeitungsmengen (1-10 ml) geeignet und sind auf eine maximale Konzentration etwa den Faktor 30x begrenzt. Beim Sammeln von HES, ist die Vermeidung der Kontamination von entscheidender Bedeutung. Um eine Kontamination mit Gastmolekülen zu vermeiden, entsorgen wir HES-containing Kulturmedien von der ersten 24 Stunden nach der erwachsene Wurm Ernte aus dem Mausdarm. Wir die Höhe der LPS Verschmutzung quantifizieren auch in jeder Charge von HES mit einem chromogenen LAL-Test (siehe 5.7). 1 U LPS entspricht ~ 100 pg LPS und Ebenen darunter werden als vernachlässigbar angesehen 23. In unseren Händen, die meisten Partien von HES deutlich unter dieser Grenze, die mittlere Konzentration von LPS in HES als 0,23 U / ug (Abbildung 5). Die Wirkungen von LPS in in vivo-Modellen der Pathologie (zum Beispiel die Unterdrückung von asthmatischen Reaktionen) benötigt mindestens 10 ng LPS 23. Daher in vivo-Verabreichung von 5 ug HES aus einer Charge mit 100 pg LPS / ug HES umfasst 500 pg LPS deutlich unter die effektive Konzentration in dem LPS zu einem Problem. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Baermann Apparat BaerMann Versuchsaufbau für die Sammlung von Erwachsenen H. polygyrus (wie in Kapitel 2 beschrieben). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Mittlere Worm Burden 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3 Larven Mittlere Wurm belastet 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3-Larven. Gezeigten Datenpunkte sind aus 19 separaten Runden der Infektion von C57BL / 6xCBA Mäusen. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Proteinprofile von HES aus aufeinanderfolgenden Wochen in Kultur SDS-PAGE-Profil von HES-Proteine ​​in aufeinander folgenden Wochen der Kultur gesammelt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: </strong&gt; Endmenge von HES 500 ml ES-haltigen Medien Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen von ca. 500 ml Kulturüberstand stammt. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: LPS Kontamination von HES Ebenen LPS Kontamination in 41 Chargen von HES durch die Limulus ameobocyte Assay gemessen. Median LPS-Konzentration = 86 U pro mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Animated H. polygyrus Lebenszyklus Zusammenfassung der wichtigsten Phasen des Lebenszyklus von orale Gabe von L3-Larven, durch Rückgewinnung von Larven und erwachsenen Würmer zu Isolierung von HES. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Animated HES und ihre Funktionen Taste immunmodulatorische Effekte von in HES enthaltenen löslichen Mediatoren und Exosomen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (und Hintergrund Stamm) </td><td> Primäre Infektion Phänotyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inzuchtstämmen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 und C57BL / 10 </td><td> Anfällig </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Zwischen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Geringe Empfindlichkeit </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für Cytokine oder Cytokinrezeptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Weniger anfällig (a); keine Änderung in der Empfindlichkeit, sondern erhöht Granulome (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2R &amp; beta; Transgenic (C57BL / 6) </td><td> Beständig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R-- / - (C57BL / 6 und BALB / c) </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c oder C57BL / 6) </td><td> Highly Resistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Beständig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, verringert Granulom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Keine Veränderung der Empfindlichkeit </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hohe Th1, Erhöhte Anfälligkeit </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für die T-Zell-Marker </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Geringfügig höheren Fruchtbarkeit </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für angeborene Immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Typ-1-Interferon-Rezeptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Widerstandsfähiger, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Anfälliger </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primäre Infektion mit H. polygyrus in genetisch unterschiedliche und gezielte Gen-Mausstämme.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus.

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.3K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus. 

Serie: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Forschung

Krebsforschung

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Einzelne Kette MHC-Technologie zur Co-Agonismus in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

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