We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

Ethics Statement: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt wurden, und wurden im Einvernehmen mit Großbritannien Home Office Richtlinien (genehmigt <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , letzter Zugriff 10 Juni , 2014) und der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , letzter Zugriff 10. Juni 2014). 1. Ocular Hypertension Induktions <ol><li> Induzieren experimentellen Glaukom durch Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) durch einseitige Injektion von paramagnetischen Mikrosphären in der vorderen Kammer des Brown-Norway-Ratten, basierend auf der Methode von Samsel et al. 3 Andere pigmentierte Ratten geeignet sein können, obwohl diese müssten validiert zuerst durch den Benutzer. </li><li> Haus von 250 bis 300 g weiblichEx-Züchter Brown Norway Ratten in einem ständigen schlechten Lichtverhältnissen (40-60 lux) auf Tagesschwankungen IOP 7 zu minimieren, mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Sie intra IOP-Messungen an wachen Tieren 8 vor der Anästhesie und Wulst Injektion, unter Verwendung eines Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge 9 kalibriert. IOP wird als Mittelwert von fünf Ablesungen vorgenommen. </li><li> Betäuben Ratten mit 37,5 mg / kg Ketamin und 0,25 mg / kg intraperitoneal Medetomidinhydrochlorid geliefert. Narkosetiefe Bestätigen Sie durch Testen hinteren Fuß Reflexe Tieres, vor der Jod-Anwendung (siehe Schritt 1.5), und Perlen Injektion Povidon (siehe Schritt 1.8). Verwalten 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie. HINWEIS: die Schüler jederzeit erweitern Sie nicht. Dies wird helfen, die Perlen, sich besser in die Kammerwinkel zu regeln, und verhindern, dass die Bindung an der Linse. Bewerben Augensalbe zur Hornhaut Trocknen auf un-betriebenen andere Auge zu verhindern. </li><li> WAsche der operativen Augen mit 5% Povidon-Iod in Wasser 10 5 min vor der Injektion. </li><li> Nach 5 min Docht die Povidoniod Ausschalten mit steriler Gaze, und waschen Sie das Auge mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Halten Sie die Augen während der Narkose bei regelmäßiger Anwendung steriler Kochsalzlösung feucht. </li><li> Legen Sie einen Ringmagneten um das Auge. </li><li> Injizieren 25 ul einer Lösung, die 30 mg / ml des gamma-Bestrahlung sterilisiert 8 um magnetischen Mikrokügelchen in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in die vordere Augenkammer, mit einer 33 G Nadel abgeschrägt. <ol><li> Um Perlen herzustellen, Waschen durch Resuspendieren und dann 3mal Zentrifugieren bei 10.000 xg für 5 Minuten mit 1 ml HBSS, bevor die endgültige 30 mg / ml Lösung. Pflegen sterilen Bedingungen im gesamten. </li><li> Für die Injektion vorsichtig sein, um zu vermeiden, die Nadel an der Iris, um das Risiko von Iris Trauma zu minimieren. Dies kann durch Ausrichten der Nadel tangential zur Hornhautoberfläche verhindert werden, die parallel zudie Iris wie möglich. Dies wird auch dazu beitragen, Perlenverlust von der Injektionsstelle zu minimieren. Hinweis: Spritzen Sie Perlen mit einer schnellen Rate, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Kammerwinkel, die entscheidend für die Anhebung IOP ist zu gewährleisten. Zusätzlich Shop Perlen, Nadeln und Magnetringe getrennt, so dass die Perlen bilden keine Cluster, so dass sie nur schwer in die Spritze zu laden und zu injizieren, und die Nadel nicht magnetisiert werden. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für 1 min nach der Injektion um sicherzustellen, dass es sich in Perlen der Kammerwinkel zu wässrigen Kondensat ab, das Trabekelwerk behindern. Leicht Winkel der Nadel nach der Perlen wurden zunächst einige Leckage von wässrigen zu ermöglichen, um eine vorübergehende Erhöhung des Augeninnendruck zu minimieren siedelt. Am Ende der Operation zu spülen Sie die Nadel durch mit ersten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), dann 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, um die weitere Verwendung der Nadel in getrennten Verfahren zu gewährleisten. Alternativ könnte man verwendenEinweg-Nadeln, wenn die richtige Spurweite und Spritze Kombination zur Verfügung. Optional: Nadeln mit Hilfe eines Schweißkantenformer, deren Nutzung zu verlängern geschärft werden. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt ggf. entfernen Sie den Magneten, und verwenden Sie es, um die Kügelchen in Bereiche unvollständige Abdeckung ziehen. </li><li> Lassen Sie den Magneten an Ort und Stelle um das Auge für weitere 10 min nach der Injektion, um sicherzustellen, Perlen absetzen gut in die Kammerwinkel. </li><li> Reverse Anästhesie unter Verwendung von 0,25 mg / kg atipemezole Hydrochlorid. </li><li> Verabreichen Chloramphenicol oder anderen Antibiotika-Salbe, beispielsweise Gentamycin oder Terramycin topisch auf eine Infektion zu verhindern, und 0,5% Proparacain-Hydrochlorid zur Analgesie. Lassen Sie Tiere auf eine Wärmematte erholen, bis sie die Bewegung wieder zu erlangen, dann in einen warmen Box und Versorgung mit zusätzlicher Nahrung, zu übertragen, wie als Nahrungsergänzungsmittel oder angefeuchtet normalen Ernährung, bis die Wiederherstellung abgeschlossen ist. Systemische oder lokale Analgesie sollte Tiere mit Anzeichen von Schmerzen 24 Stunden nach der Operation gegeben werden. Wenn thestrotz Behandlung e anhaltenden Beschwerden sollten die Tiere auf humane Weise getötet werden. </li><li> Verwenden Sie das andere Auge als nicht operierten Kontrolle. </li><li> Nehmen IOP-Messungen alle 2-3 Tage nach der Wulst Verabreichung und alle 2-3 Tage danach mit einem Rebound-Tonometer zur Verwendung im Rattenauge 9 kalibriert. </li><li> Die Kriterien für die Aufnahme in die Augen Studien können sein: wenn 1) die IOP über der kontralateralen Kontrolldruck von 5 mm Hg erhöht, und 2) nicht über 60 mm Hg nicht übersteigt. </li><li> Augen, wo der Druck wieder zum Ausgangswert (in der Regel von 1 Woche nach der Injektion) sollte nicht in die Studien aufgenommen werden, ist es jedoch möglich, wieder zu injizieren Perlen in die Augen, die zu hohen Augeninnendruck entwickeln, wenn gewünscht ausfallen. </li><li> Euthanize Tiere durch CO 2 Erstickung am Ende des Experiments. </li><li> Präparieren Sie die Augen und Sehnerven, und befestigen Sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht für weitere histologische Analyse. </li></ol> 2. Beurteilung der Netzhaut Neuron Schaden Mit TUNEL Shaltigen <ol><li> Um apoptotischen Zellen zu quantifizieren in ganze Berg retinasuse der Desoxyribonukleotidyltransferase vermittelte dUTP nick-Kennzeichnung (TUNEL) Assay, nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Präparieren der Netzhaut von der Augenmuschel, Waschen für 3 x 5 min in 0,3% Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (T-PBS). </li><li> Permeabilisieren Gewebe in 3% T-PBS für 2 Stunden. </li><li> Pre-äquilibrieren Retinae in Äquilibrierungspuffer 10 min, vor der Inkubation TUNEL Reaktionslösung 1 h bei 37 ° C. </li><li> 3 x 5 min in 0,3% T-PBS waschen das Gewebe gründlich in 0,3% T-PBS mit 5 uM DAPI und Flachhalterung bei der Montage Medien. </li><li> Zur Quantifizierung TUNEL positiven Kerne mit einem konfokalen Mikroskop bis 10 um z-Stacks durch die Ganglienzellschicht bei 20-facher Vergrößerung zu nehmen. Nehmen Sie 3 Bilder auf jedem der 4 Blütenblätter, an Orten in der Nähe des Sehnervs, in der Mitte der Peripherie, und am äußersten Peripherie der Netzhaut, was eine Gesamtzahl von 12 Bildern pro ganze mount, Probenahme ca. 7.000 Zellen. Morphologischer Kriterien unterschieden nicht neuronale (endotheliale und Glia-Zellen) aus neuronalen Zellen. </li><li> Wählen Sie die Bereiche für die Bildgebung nur mit der DAPI-Kanal und Maske Ermittler zu den Behandlungsgruppen. </li></ol> 3. Bewertung Optic Nerve Damage Mit Toluidinblaufärbung <ol><li> Fix Sehnerven Nacht in Karnovsky-Lösung bei 4 ° C. </li><li> Saures Proben für 2 Stunden in 1% (w / v) Osmiumtetroxid und anschließend in 100% Ethanol dehydriert. </li><li> Sehnerven in Propylenoxid inkubieren für 30 Minuten, und legen Sie in einer 50:50 Mischung von Propylenoxid: Araldit Nacht. </li><li> Wechseln diese Lösung zu 100% Araldit, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 60 ° C. </li><li> Cut Semidünnschnitten (0,75 mm dick) und Fleck mit 1% Toluidinblau / Borax (TB) in 50% Ethanol vor der Sachprüfung mittels Lichtmikroskopie. </li></ol> 4. Statistische Analyse <ol><li> Die statistische analysiert mit einem entsprechenden Statistik-Software-Paket. Ein Zwei-Wege-ANOVA mit der Newman-Keul Post-hoc-Test kann verwendet werden, um die statistische Signifikanz berechnen IOP über die Zeit verändert werden. </li><li> Ein p-Wert von weniger als 0,05 kann als signifikant angesehen werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

Hier zeigen wir ein Verfahren zum Induzieren erhöhten IOP bei der Ratte durch Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die Vorderkammer des Auges. Diese Methode ist einfach durchzuführen und erfordert nur wenig chirurgischem Know-how oder Stunden des Übens und Raffinesse. Weiterhin ist das Verfahren wirksam sind; selten, die mehr als eine einzige Injektion von Perlen, eine starke, robuste Druckanstieg (ca. 10% Reinjektion Rate) zu induzieren. Dies kann einen Vorteil gegenüber bestehenden induzierbaren Methoden, wie dem technisch anspruchs episceral Vene bereitzustellen Sklerose 11 Modell oder Laserphotokoagulation Protokoll 6, die mehrere Verfahren zu erhöhten IOP maintain erfordern kann. Damit die Methode, um erfolgreich sein, jedoch gibt es einige kleine kritische Schritte, die ergriffen werden müssen. Erstens ist es sinnvoll, eine Ringförmigen Magneten benutzen, um Korne in den Kammerwinkel zu zeichnen. Dieser Schritt ist eine Modifizierung des ursprünglichen Protokolls where wurden die Kügelchen in die vordere Kammer injiziert, und dann freihändig bewegt um das Auge 3. Mit einem Ringmagneten bedeutet, dass Mikrokügelchen sollten gleichmäßig um den Winkel zu regeln, minimale manuelle Umverteilung erfordern. Zu langsam, und die Perlen werden in erster Linie sammeln sich auf der einen Seite der Winkel, was zu unvollständigen Erfassung und möglicherweise ohne Druckanstieg - Zweitens sollte die Injektionsgeschwindigkeit schnell. Im Allgemeinen jedoch ist das Verfahren einfach genug, daß der Benutzer leicht Modifikationen des Protokolls, wie beispielsweise Variation der Größe oder das Volumen der Mikrokügelchen-Partikel, vielleicht, um zu versuchen, den Grad der IOP Elevation verändert werden. Allerdings ist ein möglicher Nachteil der Methode, dass ein wenig Kontrolle über das Ausmaß der Bluthochdruck, die in etwa 5-10% der Fälle haben wir beobachtet stieg über 60 mmHg hat. Übermäßiger Anstieg der IOP kann sehr schädlich für Netzhautgewebe sein und machen die Erforschung der Mechanismen und biologie des Zelltods Herausforderung. Das Verfahren erzeugt jedoch eine konsistente neuronale Pathologie, sowohl in der Netzhaut und des Sehnerven, die pharmakologisch 12 manipuliert werden kann. Dies kann das Modell attraktiv für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Glaukom zu machen. Darüber hinaus, da die Perlen in den Kammerwinkel ausgerichtet, lässt dies die Sichtachse frei für Echtzeit-Bildgebung der Netzhaut oder der Papille. Wir gehen davon aus, dass dieses Modell angepasst und für zukünftige Anwendungen in anderen Spezies, einschließlich der Maus verwendet werden.

Primäres Glaukom ist eine verheerende Augenkrankheit schätzungsweise 60,5 Millionen Menschen in aller Welt 1 zu beeinflussen, was zu lebensverändernden Sehverlust und Erblindung 2 führen kann. Die Erforschung der Krankheitsmechanismen und Entwicklung neuartiger Therapeutika für Glaukom, sind abhängig von guten Modellen der Krankheit, die einige der Markenzeichen der Pathologie zu rekapitulieren. Wir stellen hier eine Ratte Glaukommodell basierend auf der Methode von Samsel et al. 3 Das Ziel dieses Verfahrens ist es, den Augeninnendruck (IOP) in das Auge durch die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die vordere Kammer, und mit einem Magnetring direkt erhöhen sie in den Kammerwinkel. Dies behindert Kammerwasserabfluss, der IOP erhöht, was zu Nervenschäden und Zellverlust. Das Protokoll wurde entwickelt, um zu versuchen, ein einfacheres, induzierbar Modell von Glaukom ist. Dieses Protokoll kann einige Vorteile haben,gegenüber bestehenden Techniken. Genetische Maus-Modellen wie dem DBA / 2J zur Verfügung, die nicht verlangen, Verfahren einzuleiten; aber diese können eine unvorhersehbare Auftreten von Krankheitsprogression 4. Demgegenüber induzierbare Modelle, von denen die meisten auf chirurgisch Hebe IOP bei Nagetieren zu verlassen, haben den Vorteil, dass die Einleitung durch den Benutzer gesteuert werden. Einige dieser Methoden können Nachteile der eigenen jedoch haben, auch als technisch anspruchs 5, und kann mehrere Verfahren erfordern erhöhten IOP 6 zu halten. Im Gegensatz dazu ist die induzierbare Verfahren in diesem Manuskript detailliert eine einfache, wirksame und reproduzierbare Technik, die stabile, robuste Druckerhöhungen mit einem minimalen Bedarf an Reinjektion produziert. Zusätzlich, es werden aber keine teure Ausrüstung und erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten durchzuführen. Dieses Protokoll kann für die Leser, die sich um eine technisch weniger anspruchsvolle induzierbaren einzurichten geeignetGlaukom-Modell in ihrem Labor.

<table><tbody><tr><td>250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats</td><td>Harlan UK</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab Rebound Tonometer</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (ketamine)</td><td>Fort Dodge Animal health</td><td>BN1000118</td><td>37.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Domitor (medetomidine hydrochloride)</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Minim&#039;s Saline Solution</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>Toroidal magnet</td><td>Supermagnete</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G beveled needle</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Custom needle</td></tr><tr><td>Luer tip syringe</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Chloramphenicol ointment</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL staining kit</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

Die Injektion von magnetischen Kügelchen in den Kammerwinkel konsequent führte zu einer anhaltenden und robusten Druckanstieg (Abbildung 1), die an dem ersten Zeitpunkt, 3 Tage nach der Injektion leicht beobachtbar war. Ferner wurde der Druckanstieg während der gesamten Dauer des Experiments gehalten und obwohl unser Zeitverlauf beendet bei 18 Tage nach der Injektion wurden andere berichteten Druck bestehen bleibt langfristig 3. Die mittlere IOP gemittelt über die gesamte Länge des Experiments für die Steuerung, nicht-Wulst-injizierten Augen betrug 19,7 ± 0,3 mmHg gegenüber 40,5 ± 2,8 mmHg für Wulst-injizierten Augen (P &lt;0,001). Zusätzlich erhöhte Spitzen IOD von 22,8 ± 0,3 mmHg auf 49,9 ± 2,3 mmHg. Um zu bestimmen, ob die Erhöhung in IOP führt zum Tod von retinalen Ganglienzellen, führten wir TUNEL-Färbung an Retinae und Histologie an Quer Sehnerv Abschnitte (Abbildung 2). In der Netzhaut<html> Wir beobachteten einen Anstieg der TUNEL-Färbung (2A) in sicken injizierten Augen mit erhöhtem IOP. Die Anzahl an apoptotischen Kernen stieg etwa 15-fach, von 1,6 ± 0,5 Zellen in kontralateralen Kontrollen auf 24,5 ± 0,5 Zellen in hypertensive Retinae (2B; P &lt;0,05). Ferner ist in den Augen, in denen magnetische Kügelchen injiziert aber Druck nicht erhöht (wahrscheinlich aufgrund einer unvollständigen Blockade der Kammerwinkel), waren die Anzahlen von TUNEL-positiven Zellen nicht signifikant verschieden von denen der nicht-injizierten Kontrollen (P&gt; 0,05). Dies legt nahe, dass der Zelltod auf Druck ansteigt, nicht auf direkte Toxizität der magnetischen Mikrokugeln zusammen. Schließlich wurde untersucht, Sehnerv Pathologie in der Glaukommodell und sah Akkumulation von Toluidinblau in vielen der Axone, anzeigt Degeneration dieser zellulären Prozesse (2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Erhöhung des intraokularen Drucks unter Verwendung von magnetischen Mikrosphären. Die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die vordere Kammer induziert eine robuste, signifikanten Anstieg des intraokularen Drucks (IOP) im Vergleich zur contralateralen Kontroll, nicht injizierten Augen. Y-Achsen-Einheiten = Millimeter Quecksilbersäule (mmHg). Daten = Mittelwert ± SEM. * = P &lt;0,001;. N = 12. Dieser Wert wurde von Foxton et al, Am modifiziert. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Erhöhung von IOP durch Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in den Kammerwinkel, induzierten neuronalen Tod in der Ganglienzellschicht (GCL). (A) Repräsentative Bilder der Netzhaut von der Kontrolle (links) und Glaukom (rechts) die Augen für apoptotische Kerne befleckt von TUNEL (grün;weiße Pfeile) und DAPI (blau), die die Anzahl der apoptotischen Kernen erhöht IOP stieg. (B) Quantifizierung von TUNEL-positiven Zellen in der GCL und zeigt, daß die Augen mit erhöhtem IOP (Mitte), signifikant mehr apoptotische Zellen im Vergleich zu Kontrolle (links). Im Gegensatz dazu wird in sicken injizierten Augen, wo der Druck nicht steigt (rechts), keine signifikante Erhöhung der TUNEL-Färbung beobachtet wurde. Daten = Mittelwert ± SEM. * = P &lt;0,05; N = 7-8 (C) Repräsentative Bilder der Sehnerv Färbung und zeigt einen Anstieg der Toluidinblau-Ansammlung (schwarze Pfeile) in beschädigten Axone von Glaukom (rechts), aber keine Kontrolle Augen (links).. Maßstabsbalken = 50 um. Diese Zahl hat sich von Foxton et al modifiziert., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres at JoVE.com

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Aufrufe.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Serie: Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Ein Laser-induzierten Maus-Modell der chronischen Ocular Hypertension zu Sehfehler Charakterisierung

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Forschung

Medizin

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Neurowissenschaften

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

Ein Magnet Microbead Occlusion Modell Ocular Hypertension Abhängige Glaucoma in Mäusen zu induzieren

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

Ein reversibles Siliziumöl-induziertes Okularhypertonie-Modell bei Mäusen

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Eine hypertone Kochsalzlösungs-Injektionstechnik zur Induktion eines Glaukoms bei Ratten

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.