C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Alle Verfahren tierischen Patienten verwendet haben in Übereinstimmung mit den Standards des Instituts für Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Western Michigan University. 1. Tiere <ol><li> Verwenden männlichen und weiblichen Ratten Alter von 3 Monaten in dieser Studie. </li><li> Halten Sie Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von KAX Cocktail für Tier Anesthesia <ol><li> Man löst 50 mg Xylazin (20 mg / ml) in 5 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1 ml Acepromazin (10 mg / ml) und 3 ml destilliertes Wasser. Gründlich durchmischen. </li><li> Sterilisieren mit einem Spritzenfilter und speichern diese Lösung in eine 10 ml Serumflasche. </li></ol> 3. KAX Injection <ol><li> Wiegen Tier (g) und zurück zum Käfig, bis sie bereit zur Injektion. </li><li> Injizieren von 0,1 ml KAX / 100 g Körpergewicht des Tieres intraperitoneal, eine 1 ml Insulinspritze mit einer 28 G Nadel. </li><li> Zulassenfür Tier zu werden bewusstlos. Überprüfen Reflexe durch die Füße und Schwanz einklemmen. </li><li> Bewahren Sie alle Tiere sicher im Labor für die Dauer der Operation. </li><li> Post-Chirurgie, ersetzen Tiere in ihren Käfigen und halten bequem in RT, bis das Bewusstsein wiedererlangt wird. Nur Rückkehr Tiere in die Tierhaltung, wenn die Tiere erwachen und ein normales Verhalten fortzusetzen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Chirurgie und Microneedle Versammlung <ol><li> Machen Sie eine sterile 2 M NaCl-Lösung. </li><li> Verwenden Sie einen Mikroelektroden - Abzieher (1C) ein 0,86 mm Innendurchmesser schwer poliert Standard und dünnwandige Borosilikat Rohr zu ziehen , in zwei fein verjüngte Glasmikronadeln (1D, 1E). </li><li> Verfüllung eines microneedle aus dem vorhergehenden Schritt mit 2 M Kochsalzlösung eine Verfüllung Spritzennadel und einer 1 ml Spritze (1B). Tippen Sie aus Luftblasen aus der Spitze der Elektrode. </li><li> Füllen Sie eine zweite 1 ml Spritze mit 2 MNaCl. Schließen Sie eine 18 G - Nadel und legen dann eine Länge (etwa 10 Zoll) von Polyethylenschlauch (Abbildung 1A). Verwenden Sie den Spritzenkolben das Polyethylenschlauch mit Kochsalzlösung durch die Nadel zu füllen. </li><li> Wenn sowohl die Mikronadeln und Schläuche mit Kochsalzlösung gefüllt sind, sorgfältig die beiden verbinden. Beseitigen jegliche Luft in der Verbindung zwischen ihnen (Figur 2). </li><li> Fein Fase die Spitze des microneedle, indem sie es sehr leicht gegen den Strich eines Kurses Papiertuch Schaben. </li><li> Überprüfen Sie den Widerstand der Mikronadeln durch den Kolben vorsichtig auf die Spritze, bis ein feines Flüssigkeitsstrom drückt auf dem Papiertuch zu sehen. Der Strom der Flüssigkeit sollte nicht breiter als 0,5 mm sein. </li></ol> 5. Herstellung von Tier <ol><li> Tragen Sie 1-2 Tropfen Lokalanästhetikum zu Hornhaut (Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung, USP, 0,5%). Warten Sie, bis kein Augenreflex auftritt. </li><li> Trim-Whisker mit einer Schere. </li><li> Saturate ein Wattestäbchen mit Betadin Lösung und Tupfer Bereich um den experimentellen Auge. </li><li> Mit Hilfe eines Mikroskops befestigen Sie eine hemostat den unteren Augenlid zu klemmen, um das Auge zu wölben, die episklerale Vene aussetzen und Augenbewegung beschränken. (Abbildung 3, Pfeilspitze) </li></ol> 6. Glaucoma auslösende Saline Injection <ol><li> Wenn die microneedle Montage und das Tier hergestellt werden, beginnen Injektionen. </li><li> Wenn das Tier zu Fuß / Schwanz Prise nicht mehr zu reagieren bestätigt wird, sorgfältig die episklerale Vene mit dem microneedle gewaltsam öffnen , indem sie zwischen 10 und 20 Grad zur Ader (Abbildung 3, weißer Pfeil) in einem niedrigen Winkel kommen. Eine erfolgreiche Einstich in die Vene ist offensichtlich , wenn Blut die Spitze der Mikronadeln (Abbildung 3, schwarzer Pfeil) eintritt. </li><li> Langsam und manuell ca. 50 &amp; mgr; l Kochsalzlösung in die Vene injiziert. Dies sollte etwa 10 Sekunden dauern. Die Venen werden blanch weiß wie das Salz zirkuliert throigitt das Gefäßsystem (Abbildung 4, Pfeilspitze). In einigen Regionen kann eine blutrot Aussehen (Abbildung 4, Pfeil) halten. <ol><li> Durchführen einer zweiten Injektion in die Vene, gegenüber dem Ort der ersten, gründliches retinale Schädigung des vollständigen retinalen Ganglienzellschicht zu gewährleisten. Hinweis: Innerhalb von Minuten, sollte man eine deutliche trübes Aussehen durch die Iris des Auges zu sehen, wie das Salz das Gefäßsystem zirkuliert durch. </li></ol></li><li> Lassen Sie das andere Auge unbehandelt für die Verwendung als interne Kontrolle. </li></ol> 7. Tierrettung <ol><li> Entfernen Sie die hemostat. </li><li> Verwenden Sie einen Wattedreifach antibiotische Salbe (Zink-Bacitracin, Neomycin-Sulfat, polymysin B Sulfat) auf die Website von der hemostat und an Injektionsstellen geklemmt anzuwenden. Gewebeschäden um das Auge tritt nicht auf die hemostat verwenden. </li><li> &gt; Platz narkotisierten Tieren auf einer zirkulierenden Warmwasserdecke in ihren Käfigen zu prevent Hypothermie. Halten Sie Tiere unter Beobachtung, bis das Bewusstsein und ein normales Verhalten wiedergewonnen werden. Transport wach Tiere zurück in die Tierkolonie. Tiere bleiben in der Kolonie bis zum Zeitpunkt des Opfers. </li></ol> 8. Tieropfer und Retina Removal <ol><li> Einen Monat nach dem Verfahren zur Glaukom induzieren, Tiere werden durch CO 2 Ersticken und sekundäre Thorax - Stich eingeschläfert. <ol><li> Legen Sie das Tier in der Kammer und legte den Deckel auf sicher. </li><li> Öffnen Sie die CO 2 und Gasregelventile 20% Volumen / min CO 2 Verschiebung zu ermöglichen , Sauerstoff in der Kammer. </li><li> Lassen Sie vier bis fünf Minuten für das Tier zu verfallen. </li><li> Schalten Sie beide Ventile ab. </li><li> Entfernen Tier aus der Kammer und führen Sie eine sekundäre Thorax-Stich mit einem sterilen Skalpell. </li></ol></li><li> Nach Euthanasie, mit einem Skalpell das Bindegewebe in der Augenhöhle zu schneiden bei rund um das Auge,ng vorsichtig, nicht in den Augapfel selbst zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie sorgfältig gekrümmten Rand Schere, um den Sehnerv und alle verbleibenden Gewebe zu schneiden die intakte Augapfel zu extrahieren. Legen Sie extrahiert Augapfel in einem sterilen 60 mm x 15 mm Einweg-Petrischale mit frischem PBS. </li><li> Machen Sie eine Okularmuschel vom Augapfel. Um dies zu tun, stellen ein kleiner Schnitt mit dem Skalpell posterior nur an der Grenze zwischen der Iris und der Sklera. Folgen Sie dieser Einschnitt um den Umfang des Auges mit kleinen Feder Schere, um die Hornhaut Hemisphäre aus dem Augapfel zu entfernen. Die Halbkugel mit dem Sehnerv verbunden bleibt. </li><li> Finden Sie die sehr dünne rosa / beige Retina innerhalb des Okulars vom eingeschläfert Tier. Halten Sie die pigmentierte Schicht der Netzhaut mit abgestumpften Pinzette die Augenmuschel zu stabilisieren. Verwenden Sie ein anderes Paar geschlossener Zange sehr sanft die ganze intakte Retina necken weg von der Rückseite des Auges. Vermeiden Sie Kneifen, ziehen, oder die Netzhaut direkt zerren. </li><li> Verwenden Sie kleine Feder Schere die zu schneidenBereich, in dem der Sehnerv noch an der Netzhaut angebracht wird. </li><li> Achten Sie darauf, restliche Pigmentepithel oder Skleralgewebe von der Retina wegzuschneiden. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, Transfer sehr sanft die isolierte Retina zu einem sauberen Sylgard beschichtet 35 mm x 10 mm Petrischale mit frischem PBS. </li></ol> 9. Whole-Mount-Retina-Vorbereitung <ol><li> Einmal in der Sylgard Schüssel, verwenden Pinzette und ein Kaktus Nadel, um die Netzhaut an Ort und Stelle zu fixieren. Halten Sie die retinalen Ganglienzellschicht nach oben und Sehnerv nach unten. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Verwenden Sie kleine Schere, um die Netzhaut in vier Quadranten zu schneiden, die Form eines vier Kleeblatt machen von dem Sehnervenkopf ausstrahlen. </li><li> Pin den Quadranten der Netzhaut mit zusätzlichen Kaktus Nadeln der Retina so flach wie möglich zu machen without Streckung (Abbildung 5). </li><li> Befestigen Sie die gemerkte Retinae in der Sylgard Schale mit 3 ml 4% Paraformaldehyd O / N bei RT. </li></ol> 10. Antikörper-Färbung von Retina Anmerkung: Stain fixiert Retinae mit primären und sekundären Antikörpern zur Betrachtung Neuronen in der Netzhaut (6). <ol><li> Spülen Sie fixiert, flach montierten Retinae dreimal für jeweils 2 Min in PBS. </li><li> Permeabilisieren die Retinas mit 1% Triton X-100 mit 1% fötalem Rinderserum in PBS für 60 min. </li><li> Rinse Retinae dreimal 2 min jeweils in PBS. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren mit 1% Triton X-100 und 1% fötalem Rinderserum in PBS bei RT für 45 min. </li><li> Spülen zweimal mit 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min pro Waschung. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml 1% fötalem Rinderserum in PBSmit gereinigtem Maus-anti-Ratte CD90 / Maus CD90.1 (1: 300 Verdünnung) O / N bei RT. </li><li> Spülen Retinae einmal mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBS, 5 min pro Wasch. </li><li> Inkubieren jeder Netzhaut in 3 ml PBS (ohne FBS) mit sekundären Alexa Fluor 594 Ziege-Anti-Maus-IgG (1: 300), O / N bei RT. </li><li> Waschen Sie Retinae mit PBS liberal. </li><li> Mit einem Binokular, entfernen Sie vorsichtig Kaktus Nadeln von der Netzhaut. </li><li> übertragen vorsichtig Retinae auf Mikroskop-Objektträger mit einer Transferpipette. Achten Sie darauf, Orientierung mit retinalen Ganglienzellschicht zu halten an der Decke gegenüber. Die hemisphärische Form der Netzhaut ist bemerkenswert, auch nach der Fixierung. Die Krümmung der Netzhaut wird zur Decke kräuseln, wenn die retinalen Ganglienzellschicht in der gewünschten Orientierung ist. </li><li> Absorbieren überschüssiges PBS mit Kimwipe oder ein anderes derartiges Material aufnehmen. Achten Sie darauf, nicht auf die Netzhaut zu absorbieren. </li><li> 5 Tropfen ½ Glycerin und ½ PBS Gewichts als amontage Medien. </li><li> Decken Sie Retina mit Deckglas, Luftblasen vermeiden. </li><li> Sichere Deck mit klarem Nagellack, Klebstoff oder andere Kleber. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Glaukom-ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell induzieren. Dieses Verfahren verwendet eine Injektion von hypertonischer Kochsalzlösung Vernarbung in das Trabekelwerk zu induzieren 29, 32. Die Entwicklung Gewebenarben den Abfluss von Kammerwasser okkludiert , die Druck in der vorderen Kammer erhöht. Mit verminderten Abfluss und Druck aufzubauen, wird die Linse durch elastische Bänder suspendiert schiebt wieder in den Glaskörperraum. Vitre...

Glaukom ist eine Gruppe von Augenkrankheiten , Nervenzellen in der Netzhaut zu beeinflussen, insbesondere die retinalen Ganglionzellen 1-2. Die Axone dieser Zellen konvergieren der Sehnerv visuelle Information tragenden zum Gehirn zu werden, wo die Sicht wahrgenommen wird. Schäden an RGCs und ihre Axone führt daher zu Sehfehler. Die primären Merkmale im Zusammenhang mit Glaukom-Erkrankungen sind RGC Degeneration und Tod, erhöhter Augeninnendruck (IOP) und Papille Schröpfen und Atrophie. Diese Eigenschaften führen zu Gesichtsfeldausfällen oder vollständige, irreversible Blindheit. Derzeit hat 3 Blindheit in 70 Millionen Menschen weltweit Glaukom verursacht. Als solches ist es die drittgrößte Ursache für Erblindung 4 der Welt. Der genaue Mechanismus der RGC Tod in Glaukom bleibt unbekannt. Viel Forschung wurde das Geheimnis zu entsperren getan. Es ist jedoch bekannt, dass der primäre Risikofaktor für Glaukom ist eine Zunahme in intraokularen Drucks aufgrund unregelmäßiger Zirkulation von wässrigem Humor (AH) in der Vorderkammer des Auges. AH dient als transparent und farblos Ersatz für Blut in der avaskulären Vorderkammer des Auges. Es nährt die umliegenden Zellen, entfernt sekretiertes Abfallprodukte aus Stoffwechselprozesse, transportiert Neurotransmitter und ermöglicht die Verbreitung von Drogen und Entzündungszellen innerhalb des Auges während der pathologischen Zustände 1. Die Aufrechterhaltung der wässrigen Humor Zirkulation beinhaltet die Ziliarkörper und das Trabekelwerk. Wässrige Humor wird durch den Ziliarkörper produziert. Es fließt dann in die vordere Kammer, die allgemeine Gesundheit des Augengewebes zu halten. 75-80% der wässrigen Abflusses wird aktiv durch nichtpigmentären Ciliarepithel sezerniert, wenn die Flüssigkeit durch drei Schichten des schwammigen Gewebe im Ziliarmuskel gefiltert wird. Das Fluid tritt durch das Trabekelwerk und durch den Schlemmschen Kanal, empties in das Blutsystem 5 .Die restlichen 20 - 25% der Abfluss umgeht das Trabekelwerk und wird passiv durch Ultrafiltration und Diffusion durch die uveo-skleralen Weg abgesondert. Dieser Weg scheint relativ unabhängig von den intraokularen Druck 1 zu sein. Wenn Kammerwasserproduktion und Abfluss aus dem Gleichgewicht geraten sind, baut den Druck im Auge. Wie bereits erwähnt, diese Erhöhung des intraokularen Drucks ist der primäre Risikofaktor bei der Entwicklung von Glaukom. Ein solcher Druck bewirkt, dass eine Beschädigung der komplizierten Schichten von Neuronen in der Netzhaut auf der Rückseite des Auges. Eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen Axone des Sehnervs verursacht das Gehirn nicht mehr präzise visuelle Informationen zu erhalten. Als Ergebnis ist die Wahrnehmung des Sehvermögens verloren und vollständige Blindheit auftreten können. Bis heute gibt es keine Heilung für Glaukom. Verschiedene Behandlungsmethoden gibt, die in erster Linie den intraokularen Druck zu reduzieren wollen. Dazu gehören die topischeMedikamente Klassen wie Beta1-Rezeptorenblocker oder topische Prostaglandin-Analoga. Betablocker reduzieren die intraokulare Druck durch die Produktion von Kammerwasser 7 abnimmt. Prostaglandine fungieren IOP zu reduzieren , indem der Abfluss von Humor aquosus 8-14 erhöhen. Alpha-adrenergen Agonisten und Carboanhydrasehemmer sind auch als sekundäre Behandlungsmethoden verwendet werden. Alpha - adrenergen Agonisten erhöhen Abfluss durch den uveosklerale Weg 15-17. Carboanhydrasehemmer reduzieren die Produktion von AH durch enzymatische Hemmung 18. Viel mehr invasive Verfahren werden auch zur Behandlung von Glaukom verwendet wird. Lasertrabekuloplastik wird verwendet , 19 , um den Abfluss des Kammerwassers zu erhöhen. Eine weitere chirurgische Therapie, die so genannte Trabekulektomie schafft eine alternative Entwässerung Website AH zu filtern , wenn der traditionelle trabekulären Weg wird 20-21 blockiert. Diese Behandlungsoptionen wurden zu eff bekanntektiv IOP verringern. Jedoch bis zu 40% der Glaukompatienten für vollständigere therapeutischen Verfahren eine Notwendigkeit , den normalen IOP Ebenen zeigen anzeigt. 22,23 Zusätzlich ist Retinal Ganglion Zelltod in Glaukom gesehen irreversible sobald es und aktuellen Behandlungen beginnt nicht das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen 24-28. Dies hat die Notwendigkeit einer wirksamen neuroprotektiven Therapien hervorgehoben, dass das Überleben der Neuronen selbst ausrichten. Entwicklung von Glaukom-Modelle ist für diese Entwicklung entscheidend. In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Induzierung von Glaukom-ähnliche Effekte in erwachsenen Long Evans - Ratten mit einem modifizierten Verfahren unter Verwendung von ursprünglich umrissenen von Morrison 29. In diesem Verfahren werden Injektionen von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in dem episkleralen venösen Plexus induziert Glaukom ähnlichen Bedingungen durch Gewebe Vernarbung wässrigen Abflusses in das Trabekelwerk zu einem Anstieg des intraokularen Drucks und einem signifikanten Verlust an RGCs was zu reduzieren within eines Monats nach dem Verfahren 30-31. Glaucoma-induzierenden Verfahren, wie das hier beschrieben ist, kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Entwicklungen in Glaukombehandlung.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Das Glaukom ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems retinale Ganglionzellen (RGCs). RGC Axone des Sehnervs führen für die visuelle Wahrnehmung an das Gehirn visuelle Eingabe bilden. Schäden an RGCs und ihre Axone führt zu Verlust der Sehkraft und / oder Blindheit. Obwohl die spezifische Ursache des Glaukoms nicht bekannt ist, ist der Hauptrisikofaktor für die Erkrankung ein erhöhter Augeninnendruck. Glaucoma-induzierende Verfahren in Tiermodellen sind ein wertvolles Werkzeug für Forscher, den Mechanismus der RGC Tod studieren. Diese Informationen können zur Entwicklung von wirksamen neuroprotektiven Behandlungen führen, die bei der Prävention von Verlust der Sehkraft unterstützen könnte. Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt ein Verfahren Glaukom induzieren - ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell , bei dem 50 ul von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in das episkleralen venösen Plexus injiziert. Blanchieren der Gefäße zeigt die erfolgreiche Injektion. Dieses Verfahren führt zu einem Verlust von RGCs Glaukom zu simulieren. Einen Monat nachInjektion werden die Tiere getötet und die Augen entfernt. Als nächstes werden die Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt, um eine Okularmuschel zu machen. Die Netzhaut wird dann von der Rückseite des Auges geschält und auf Sylgard Gerichte mit Kaktus Nadeln festgesteckt. An diesem Punkt Neuronen in der Netzhaut kann zur Analyse gefärbt werden. Die Ergebnisse aus diesem Labor zeigen, dass etwa 25% der RGCs innerhalb eines Monats nach dem Verfahren, wenn die interne Kontrolle im Vergleich verloren. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Retinal Ganglion Zelltod in einem in vivo Rattenmodell Glaukoms.

Dieser Abschnitt stellt die Gerätekomponenten und Verfahren verwendet , um Glaukom ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Ratten Glaukom Modell induzieren. Wir zeigen die einzelnen Werkzeuge und Geräte mit einer hypertonen Kochsalzlösung-Injektion auszuführen verwendet, die eine Erhöhung des intraokularen Druckes bewirkt. Wir zeigen die Injektion in den episkleralen venösen Plexus mit seinen charakteristischen Blanchierung Effekt und die trübes Aussehen der vorderen Kamm...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K Aufrufe.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Serie: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat In-vitro-

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Biotechnik

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

Ein Magnet Microbead Occlusion Modell Ocular Hypertension Abhängige Glaucoma in Mäusen zu induzieren

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Medizin

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Das Nagetier-Modell der nonarteritic anteriore ischämische Optikusneuropathie (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biologie

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

Transkonjunktivaler Zugang zur Injektion in den Sehnerv der Ratte

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Eine hypertone Kochsalzlösungs-Injektionstechnik zur Induktion eines Glaukoms bei Ratten

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Glaucoma auslösende Verfahren in ein

Zusammenfassung

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