Name: high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
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The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

HINWEIS: Dieses Protokoll kann für mehrere Anwendungen, wie die Quantifizierung der Phagozytose und Aktin-Polymerisation verwendet werden, wie in unserer früher veröffentlichten Arbeit 12 verwendet. Das Protokoll eignet sich für eine Vielzahl von Modifikationen und Tabelle 1 listet Zelltypen und Teilchen erfolgreich in früheren Studien verwendet. Standard Verwendung dieses Protokolls für die Quantifizierung der Phagozytose oder der Aktin-Polymerisation ist in Abbildung 1 dargestellt. <img alt="Diagramm 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Diagramm. 1: Schema der fluorometrischen Assay zur Quantifizierung der Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Nachdem die Zellen plattiert, behandelt, und man ließ sie haften Teilchen mit grüner Fluoreszenz (FITC) markiert sind, zu den Zellen für die Phagozytose aufgenommen. Die Reaktion wird durch Trypanblau oder antibi gestopptOhrwäsche (auf nicht internalisierten Partikel zu beseitigen) und Fixierung mit 4% Paraformaldehyd durchgeführt. Die Zellen werden anschließend mit rot fluoreszierende Aktin-Etikett (Rhodamin-Phalloidin) und blau fluoreszierende Markierung (DAPI) gefärbt. Indizes der Phagozytose und Aktin-Polymerisation werden als Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grün / blau (FITC / DAPI) oder rot / blau (Rhodamin / DAPI) Fluoreszenz quantifiziert. 1. Auflage und Behandlung von Zellen HINWEIS: Bevor Sie beginnen, Erwägung ziehen, die Behandlungen mit mindestens 4 technische Replikate und umfassen die folgenden Steuerelemente in der Platte Layout: Zellen, die nur (ungefärbt, mit DAPI allein oder Rhodamin allein) und Partikel nur. <ol><li> Führen die gesamten Zugabe der Reagenzien in den Schritten in einem sterilen Zellkulturhaube, um die Proben vor Verunreinigung zu schützen 1-4. </li><li> Platte Makrophagen (J774 murine Zelllinie) in einer 96-Well-Platte bei 1-5 × 10 4 Zellen in 50 &amp; mgr; l (pro Vertiefung)<html> der vorgeheizten Medien ergänzt. Ideal Platten für diese Methode sind schwarz 96-well Platten mit klarem oder schwarz Böden in Abhängigkeit von Lesefähigkeiten. <ol><li> Für ergänzten Medium verwenden 10% hitzeinaktiviertem FBS, um Störungen der Komplementkaskade zu vermeiden, und 1% Penicillin / Streptomycin (wenn nicht mit lebenden Bakterien zur Phagozytose). Bei der Verwendung von adhärenten Zellen ermöglichen 1-2 h für die Haftung und für die nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte mit den Zellen für 10 Minuten bei 500 x g. </li></ol></li><li> Hinzufügen gewünschten Agonisten / Antagonisten oder Fahrzeugsteuerung in 2facher Konzentration (in PBS resuspendiert oder bevorzugter in ergänztem Medium) in 50 &amp; mgr; l für ein Endvolumen von 100 ul (1x) und Inkubation für eine gewünschte Zeitdauer. Mehrkanalpipette und Reagenziengefäßen wird schnellsten Verarbeitung zu erleichtern. </li></ol> 2. Opsonisierung von fluoreszierenden Partikeln ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tabelle 1: Getestete Zelltypen und Leuchtstoffpartikeln in fluorometrischen Analyse Phagozytose und die Aktin-Polymerisation Tabelle 1 zeigt Kombinationen von Zelltypen (Zelllinien und Primärzellen), hat unsere Gruppe über das fluorometrische Verfahren verwendet.. Andere als Blick auf die Phagozytose und Aktin-Polymerisation von Wildtyp-Zellen, haben wir auch einige dieser Partikel verwendet zur Untersuchung der Phagozytose von transfizierten Zellen ein GFP (green fluorescent protein) abzugeben. . Fluoreszenz der Zellen mit Plasmiden, die fluoreszierende Reporter transfiziert kann auch als zellulärer Marker neben DAPI Tabelle Beschriftung verwendet: A - Aktin-Polymerisation; P - Phagozytose; PT - Phagozytose von GFP-markierten transfizierten Zellen; OPDex - opsonisierten Dextran Wulst; HKOP - Wärme getötet opsonisierten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Leuchtstoffpartikel und Etiketten sind aus Licht zu jeder Zeit geschützt, during Verarbeitung, Waschen, als auch während der Inkubation, um die Photobleichung zu verhindern <ol><li> Für trockene Partikel, abwiegen fluoreszierende Hitze getötet opsonisierten (HKOP) Bakterien (E2861: E. coli K-12-Stamm), mit Herstellerangaben. Achten Sie darauf, dass die Masse macht 10 zu machen: 1 - 20: 1-Bakterien: Zellverhältnis (oder zumindest eine 10: 1-Verhältnis - häufig in Quantifizierung der Phagozytose genutzt) 13,14. Zahl der Partikel kann durch den Hersteller oder vorgesehen, über couting seriellen Verdünnungen von 1 mg / ml Stammlösung bestimmt werden. </li><li> Resuspendieren in 50 ul PBS und Vortex für 1 Minute bei höchster Stufe. Sorgen Sie für sorgfältige Vortex (hier und in der Protocol), wie die Partikel zur Aggregation neigen, die Wirksamkeit von Opsonisierung auswirken können. </li><li> Für Partikel in Suspension, wie fluoreszenzmarkierte Dextranperlen (DEX Kügelchen), Wirbel die Vorratslösung für 1 min, zu 50 ul der Suspension oder in Abhängigkeit von der Perlenkonzentration im Volumen determine Berg der Perlen zu erleichtern 10: 1 Perle: Zellverhältnis. </li></ol></li><li> Gleiches Volumen des opsonierende Reagenz auf die Partikel und kräftig vortexen für eine weitere Minute. </li><li> Die Teilchen Inkubieren mit Opsonisieren Reagenz bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation zentrifugiert werden die Partikel für 5 Minuten bei 500 · g, und entfernen Sie den Überstand mit überschüssigem opsonierende Reagenz. Waschen der Teilchen durch Zugabe von 100 ul PBS, um Wirbel des Pellets und Zentrifugat für 5 min bei 500 x g zu resuspendieren. <ol><li> Wiederholen Sie diese Schritte zweimal, um die ordnungsgemäße Opsonisierung und Entfernung der nicht gebundenen Antikörper zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Herstellung der Arbeitslösung von opsonisierten Partikeln durch Resuspendieren in 5 ml Medium (ausreichend für eine Platte mit 96 Vertiefungen) und weg von Licht zu speichern, bis hinaus zu den Zellen. </li></ol> 3. Phagozytose <ol><li> Legen Sie die Arbeitslösung von Partikeln in einem sterilen Reagenzreservoir. Von hier aus werden 5056; l opsonisierten Partikeln zu den Zellen aus Schritt 1 (bei ​​einer Endkonzentration von 50 ng / ml) hergestellt und ermöglichen es die Phagozytose an Standard-Zellkulturbedingungen auftreten. Die nachstehende Abbildung zeigt zwei Methoden der Phagozytose, die mit dieser Methode (Bild 2) bewertet werden können. </li></ol><img alt="Diagramm 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Diagramm. 2: Vergleich der kontinuierlichen Vergleich synchronisieren Phagozytose Continuous Phagozytose zeigt permanenten Internalisierung von Teilchen mit der Zeit, da sie bei sich langsam die Zellen auf dem Boden der Vertiefung. Ein kontrasSynchronisationsSchritt (Zentrifugation) zwingt die Teilchen auf den Boden sinken, die Verbesserung der Partikel Kontakt mit der Zelle und führt zu sofortiger Internalisierung durch die Zellen. Synchronisierte Phagozytose ist ein schneller Prozess, der schneller verinnerlicht Teilicles aufgrund der erhöhten Zell: Partikelkontakt. <ol><li><ol><li> Für die kontinuierliche Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Zellen kontinuierlich zu phagozytieren opsonisierten Bakterien, wie sie langsam zu Boden sinken und in Kontakt mit Zellen, nutzen mehr Zeitrahmen, damit für die Bakterien, um die Unterseite des Brunnens zu erreichen und in erlauben Berühren Sie mit den Zellen. Wenn die Durchführung einer Zeitverlaufsexperiment, fügen Bakterien in unterschiedlichen Zeitintervallen und stoppen die gesamte Platte aus Reaktionen bei der gleichen Zeit, um die Verarbeitungsgeschwindigkeit zu erhöhen. </li><li> Für die synchronisierte Phagozytose Verfahren (Bild 2), die Partikel verbessert: Zell-Kontakt durch Zentrifugation, drehen Sie die gesamte Platte, die Zellen und Partikel (5 min bei 500 xg), sobald die Partikel aufgenommen, um die Synchronisation von allen Zeitpunkten zu erleichtern und Zell-Interaktion: das Teilchen zu beschleunigen. <ol><li> Messung des zeitlichen Verlaufs beginnend unmittelbar nach Beendigung der centrifugation Schritt. Wenn die Durchführung einer Zeitverlauf Experiment zu stoppen jeder Stelle unabhängig in unterschiedlichen Zeitabständen, wie unten beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> HINWEIS: Die synchronisierte Phagozytose Methode ist etwas aufwendiger von dem vorherigen, aber eine höhere phagozytischen Index in einer kürzeren Zeit. 4. Stoppen Phagozytose <ol><li> Für adhärente Zellen, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 50 ul Trypanblau verdünnt mit PBS (1: 2 Verdünnung), um die Fluoreszenz von nicht internalisierte Bakterien auszulöschen. </li><li> Für nicht-adhärenten Zellen, drehen Sie die Platte und entfernen Überstand. In 50 ul verdünnt Trypanblau. Zu gewährleisten, um die Platte um (5-10 min bei 500 xg), die zwischen jedem Waschen, um die Zellenverlust zu minimieren und ermöglichen ein ausreichendes Waschen Zentrifuge. </li><li> Nach Trypan Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um restliche Trypan zu entfernen (bis die PBS entfernt vom Bohrloch dreht sich frei). Trypan wurde gezeigt, dass Fluoreszenz 15,16 der nicht internalisierte fluoreszierend markierten, durch Hitze abgetöteten Bakterienpartikel quenchen, aber nicht für lebende Bakterien oder OPDex Perlen. Für lebende Bakterien, zählen ein Waschgang mit Antibiotika wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin oder anstelle des Trypan waschen, um verwirrende Auswirkungen der Fluoreszenz von nicht internalisierte Partikel zu vermeiden. </li><li> Fix Zellen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd, und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, dann Waschen mit PBS (100 &amp; mgr; l pro Vertiefung für jeden Waschgang). Bei diesem Schritt speichern Sie die Zellen bei 4 ° C bis zu einer Woche, oder gehen Sie direkt zum Färben und Quantifizierung. HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte bilden diesen Punkt Vorwort außerhalb des Zellkulturhaube durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie alle flüssigen und fügen Sie 50 ul der DAPI bei 5 ng / ml in PBS rekonstituiert. Lassen Sie 5 Minuten für die Färbung und dann zweimal mit PBS waschen. Nach dem Waschschritt werden 50 ul PBS in jede Vertiefung und Aufzeichnungs Phagozytose. </li&gt; </ol> 5. Aktinfärbung HINWEIS: Neben Phagozytose wird fluorometrischen Verfahren die Quantifizierung von Aktin-Polymerisation durch Messung der Intensität von Aktin, die während Hemmung Lamellipodien pseudopodiae verringert wird, und die Membran Kräuseln infolge der Behandlung mit einem Inhibitor (1A) zu ermöglichen. Dies ist ein optionaler Schritt, wenn in Quantifizierung Actinpolymerisation interessiert neben der Phagozytose. Wenn Actinpolymerisation das Endziel ist, unter Verwendung von fluoreszierenden Teilchen zur Phagozytose ist optional. <ol><li> Nach Para Fixierung (Schritt 4.3), waschen Sie die Platte zweimal mit PBS auf 100 ul pro Vertiefung für jeden Wasch. Dann werden 50 ul 0,1% Triton X-100 in PBS zur Permeabilisierung inkubieren -5 min bei RT. </li><li> Mit PBS auswaschen 0,1% Triton X-100 2-mal (wie oben), und der Block mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 20 min nicht-spezifische Bindung von Elbe zu vermeidenl. </li><li> Nach der Blockierung entfernen Sie die BSA-Lösung und sofort hinzufügen Rhodamin-Phalloidin. Um die Arbeitslösung von Rhodamin-Färbung vorzubereiten, verwenden Sie 100 ul der Methanlösung (des Herstellers) in 5 ml PBS (ausreichend für eine Platte). Von der Arbeitslösung werden 50 ul pro Vertiefung und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Im Anschluss an die Waschschritte und DAPI-Färbung, wie in Schritt 4.4 Zellen bereit für die Quantifizierung können. </li></ol> 6. Quantifizierung <ol><li> Um die Phagozytose unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten grüne Fluoreszenz mit Anregungsfilter bei λ = 488 nm und Emissionsfilter bei λ = 518 nm und blaue Fluoreszenz quantifiziert mit Anregungsfilter bei λ = 355 nm und Emissionsfilter bei λ = 460 nm. </li><li> Um die Aktin-Polymerisation unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät, Platten blaue Fluoreszenz über λ = 355 nm und λ = 460 nm (wie oben), und rot-Grippe zu quantifizierenFluoreszenz durch Anregungsfilter bei λ = 584 nm und Emissionsfilter λ = 620 nm. HINWEIS: Orbital oder Zentralerkennung ist für die Aufnahme akzeptabel. Einige Zelltypen zu sammeln mehr an den Rand des Brunnens als in der Mitte, in welchem ​​Fall Orbital Aufnahme kann von Vorteil sein. Insbesondere könnte durchschnittlich drei Punkten um die Umlaufbahn auch verwendet werden, um genauere Ergebnisse zu erhalten. </li><li> Teilen Sie die Gesamt RFU der grünen oder roten Fluoreszenz durch blaue Fluoreszenz Anzeige (von DAPI), abhängig von der Partikel Etikett oder phagozytischen gegen Aktin Quantifizierung (Diagramm 1). Aufgrund der hohen Platte-zu-Platte Varianz verwenden relativen Indizes (wie beispielsweise in Bezug auf t = 0 Steuerung), um zu veranschaulichen am besten beobachteten Trends und zuverlässiger statistischer Analyse zu erleichtern. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Hauptbeschränkungen der fluorometrischen Technik sind experimentelle Varianz sowie Zellverlust bei ausgiebigem Waschen und Verwendung von nicht-adhärenten Zellen assoziiert. Varianz ist weitgehend durch die Variation der Fluoreszenzpartikeln als Wäge- und Pipettieren während der Herstellung der Stammlösung beobachtet keine genaue Möglichkeit der Beibehaltung identischer Teilchenzahlen von Experiment zu Experiment. Um das Problem der Abweichungen zwischen Experimenten befassen, können ...

Quantifizierung der Fluoreszenzsignal wurde in großem Umfang in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Methoden, die von PCR verwendet, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse ELISA multiplexen. Fluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung hat eine breite Anwendung und kann ein großes Werkzeug für die quantitative Analyse von verschiedenen zellulären Prozessen sein. Verwendung von fluoreszierenden Markierungen mit Signal in den letzten zehn Jahren revolutioniert worden, und das Auftreten von Fluoreszenzplattenleser hat den hohen Durchsatz Quantifizierung der Fluoreszenz während zellulären Prozessen emittierten erleichtert. Fluorometrische Analyse kann als großartiges Werkzeug in die Quantifizierung der Phagozytose zu dienen. Phagozytose wurde seit der Entdeckung durch Phagozyten Metchnikoff 1800 1 untersucht. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von Verfahren verwendet worden, um diese wichtige Prozess prüfen wesentlich für angeborene Immunabwehr gegen eindringende bakteriellen, viralen, Pilz- und parasitären Erregern 2-5. Bisherige Verfahren zur Quantifizierung genutzt Mikroskopie und stereoTechniken, um Zellen, die phagozytierenden werden, die dann durch Zählen von internalisierten Partikeln (manuell oder unter Verwendung von Software) 6-8 quantifiziert wurden visualisieren. Einige Nachteile der Verwendung Mikroskopie allein zur quantitativen Analyse sind, dass eine manuelle Auszählung der Bakterien ist arbeitsintensiv und anfällig für ein Vorurteil des Beobachters. Ein weiteres bei der Quantifizierung der Phagozytose verwendete Methode ist die mikrobiologische Verfahren der Plattierung von Bakterien aus Zelllysaten (folgenden Phagozytose) auf Bakterienkulturplatten, aber dieses Verfahren kann nicht für bakterizide Mechanismen und Gegenwart von partiell internalisierte Bakterien stellen. Diese Methode ist noch arbeitsintensiv im Vergleich zu Mikroskopie und dauert mehrere Tage, um zu analysieren. Durchfluss-Zytometrie scheint, um die schnellste und effektivste Weg, um Phagozytose zu quantifizieren und wurde von vielen Gruppen 9-11 verwendet worden, aber die hohen Kosten allgemein mit der im zugehörigenInstrument für die Analyse erforderlich macht es die teuerste Methode im Vergleich zu den zuvor genannten Assays. Die fluorometrische Methode ist eine gute Alternative zu Zytometrie zur Analyse von Partikel Internalisierung fließen denn es bietet unvoreingenommene Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe von Geräten, die nicht so kostspielig. Andere zusätzlichen Vorteile der Fluorometrie sind hoher Wirkungsgrad und eine hohe Durchsatzvermögen zu quantifizieren Fluoreszenz von den markierten Partikeln emittierte internalisiert. Vorteile der Fluorometrie kann Quantifizierung andere als Phagozytose Prozessen extrapoliert werden. Beispielsweise kann fluorometrische Analyse angewendet werden, um jeden Prozess, der auf Veränderungen in der Expression von intrazellulären oder membrangebundene Rezeptoren, Veränderungen in der Zelldurchlässigkeit / Lebensfähigkeit Transfektionseffizienz und Modulation in einer Aktin-Polymerisation zu untersuchen. Ein Nachteil der fluorometrischen Technik ist, dass, abhängig von den verwendeten Etiketten, es kann eine hoch seinExperiment, um die Variabilität in der Regel durch den Nachweis von Daten über relative Quantifizierung, wie fache Veränderung oder Prozent aus Steuer gelöst werden können, zu experimentieren.

<table><tbody><tr><td>1 &amp;mu;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td><td>Molecular Probes</td><td>F8852</td><td>combine 50&amp;mu;l with 50&amp;mu;l opsonizing reagent for 30 min at 37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Heat killed &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BioParticles fluorescein conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>E2861</td><td>reconstitute (5 mg) in 50 &amp;mu;l of PBS and combine with 50 &amp;mu;l opsonizing reagent for 30 min at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Opsonizing reagent</td><td>Molecular Probes</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:</td></tr><tr><td>RPMI Cell growth media</td><td>Gibco</td><td></td><td>Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Fluorescent plate reader - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>dilute to 4% before use</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>clear or black or clear bottom - black plates</td></tr><tr><td>Multichannel pipette (8 - 12 channels)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes (0.6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conicles (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

Das Ziel der fluorometrischen Analyse ist es, als eine effiziente, kosteneffektive und qualitativ Durchsatzverfahren zur Analyse von Phagozytose und andere zelluläre Prozesse dienen. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen, sowohl adhärenten und nicht-adhärenten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Eigenschaften zu untersuchen. Bei der Untersuchung von Phagozytose, fluorometrische Technik nutzt phagozytischen Zelltypen, wie Makrophagen und fluoreszenzmarkierten opsonierten Partikel, deren Fluoreszenz in Gegenwart von Trypanblau ausgelöscht werden. Nach Plattierung der adhärenten Makrophagen in 96-Well-Platten, fluoreszierenden Partikeln (grün oder rot) verwaltet und Zellen werden für unterschiedliche Zeitdauern zu phagozytieren. Nach Internalisierung von fluoreszierenden Teilchen, werden die Zellen mit Trypan-Blau, das Erlöschen des Fluoreszenzsignals von den Bakterien, die nicht internalisiert werden, oder lediglich an der Zelloberfläche anhaften erleichtert gewaschen. Nach dem Trypan Waschen werden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert, einnd mit DAPI (blau Atomfluoreszenzmarkierung), die Kerne von Zellen zu markieren dient gefärbt. Durch eine einfache fluorometrische Quantifizierung durch die Platte Lesen von Kern (blau) oder Partikel (rot / grün) Fluoreszenz können wir das Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grünen untersuchen: blau und bestimmen einen phagozytischen Index, der Menge an Fluoreszenz Bakterien verinnerlicht pro Zelle. Die Dauer des Assays unter Verwendung einer 96-Well-Verfahren und ein Mehrkanal-Pipetten zum Waschen, vom Ende der Phagozytose zu Ende der Datenerfassung, weniger als 45 min. Durchflußzytometrie könnte in ähnlicher Weise verwendet werden, aber der Vorteil der Fluorometrie ist seine hohe Durchsatz, schnelles Verfahren zur Beurteilung mit minimaler Manipulation von Proben und schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Ähnliche Strategien können zu nicht anhaftenden Zellen, Live-markierten Bakterien, Aktin-Polymerisation, und praktisch jedes Verfahren, bei dem Fluoreszenz angewendet werden. Daher ist Fluorometrie eine vielversprechende Methode wegen seiner geringen Kosten, hoher throughput-Fähigkeiten bei der Untersuchung von zellulären Prozessen.

Zwei wichtige Arten von Quantifizieren Phagozytose und die anschließende Aktin-Polymerisation durch die Verwendung dieses Protokolls ist es, kontinuierlich oder synchronisiert Phagozytose beobachten. Die mikroskopische Analyse (1B) zeigt Fluoreszenzbilder vergleichbar, was das Fluorometer aufnimmt (siehe auch Abbildung 1). In 1B sind rote Fluoreszenz von Aktin, grün 268 Fluoreszenz von FITC-Etiketten HKOP E. coli, Kern DAPI-Färbu...

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K Aufrufe.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Serie: High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Neurowissenschaften

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Biologie

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...