Name: induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
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We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der University of Ottawa Animal Care Ethikkommission genehmigt wurde, zu den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care haften. 1. Präoperative Vorbereitung und Materialien <ol><li> Plasmidpräparation: <ol><li> Bereiten Plasmiden unter Verwendung des Qiagen MegaPrep nach dem Protokoll des Herstellers. Innoculate mindestens 400 ml LB-Medium mit transformierten Bakterien, um eine hohe DNA-Ausbeute zu gewährleisten und Inkubation über Nacht. </li><li> Resuspendieren Plasmid in 100-200 ul TE auf eine Endkonzentration von wenigstens 5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l. Aliquoten DNA und bei -20 ° C. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, nicht ausfallen und Resuspendieren da dies Verunreinigungen hinzufügen. Starten Sie mit einem neuen Präparat. </li><li> Vor der Operation, verdünnte ein einzelnes Plasmid (Cre-GFP zum Beispiel) zu 2 ug / ul in sterilem Wasser mit 1 &amp; mgr; l von 0,1% (w / v) Fast Green Farbstoff pro 10 oder 20 &amp; mgr; l verdünnt Plasmidlösung. Wenn GFPund das Gen von Interesse sind, auf getrennten Plasmiden co-elektroporiert werden, spritzen die GFP-Plasmid und das Plasmid, das das Gen von Interesse in einem Verhältnis von 1: 4, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass alle mit GFP markierten Zellen werden mit beiden co-elektroporiert Plasmide. </li></ol></li><li> Ziehen Glas Mikrokapillarröhrchen (1 mm Außendurchmesser - im Folgenden als Nadeln bezeichnet) auf einem Standard-Nadelzieher, mit einem einzigen Schritt Pull bei 62 ° C. </li><li> Autoklavieren eine chirurgische Packung, die die folgenden: Nadelhalter, Wundhaken, Zangen, Scheren für die Chirurgie, Scheren für Nadeln, Hefter, Heftklammern, Gaze, Wundabdeckungen, OP-Abdeckungen (1A, B, Werkstoff-Tabelle). </li><li> Sammeln Sie anderen erforderlichen Werkzeuge: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 oder 7 mm), Kochsalzlösung, Naht, 5-ml-Spritze (Werkstoff-Tabelle). </li></ol> 2. Bereiten Maus für Chirurgie <ol><li> Zur Schmerztherapie, spritzen ein zeitlich-pregnant Maus mit Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) eine Stunde vor der Operation. Wenden Sie dieses Protokoll, um Mäuse überall von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) E17.5 zeitgleich. </li><li> Verwenden Sie Microloader Pipettenspitzen zu Back-Last gezogen Nadeln mit dem Plasmid-Lösung. Nicht ganz zu füllen nicht in die Spitze der Nadel noch da sonst die Nadel verstopft zu werden. </li><li> Betäuben Maus unter Verwendung von 2-5% Isofluran Gas mit 1 l / min O 2. Sobald unbeweglich, legen Sie in der Gesichtsmaske und wenden Salbe die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Injizieren mit 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan im Rücken. HINWEIS: Bei der Arbeit mit Isofluran Gas, mit einem Gas-Scavenger, um überschüssiges Gas zurückerobern und verhindern, dass sie an der Flucht in den Raum. </li><li> Rasur Bauch. Waschen Sie Bauch mit Chlorohexadine Peeling, mit Wasser abspülen, und tragen Sie eine endgültige Lösung von prep chlorohexadine und 70% Ethanol. Abdeckung Maus mit sterilen Tuch oder Gaze zu Pelz ab, sondern lassen Leib ausgesetzt sind (Abbildung 1 C, D). </li></ol>In utero Elektroporation <ol><li> Einen Einschnitt in die Haut über dem Bauch zwischen den unteren Zitzen. Ziehen Sie die Haut von der zugrunde liegenden Muskelschicht durch Abreißen des Bindegewebes, dann durch das Bauchfell geschnitten in die Bauchhöhle entlang der Linea alba. Legen Sie die Wundhaken, um die Wundränder auseinander zu ziehen. </li><li> Entfernen Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legte es wie gezeigt (Abbildung 1E). <ol><li> Wenn verschiedene Welpen mit verschiedenen Plasmiden (wie GFP gegen GFP mit dem Gen von Interesse) eingespritzt werden, zählen die Jungen auf jeder Seite und entscheiden, welche und wie viele mit jedem Plasmid injizieren. Ersetzen Sie eine Seite der Gebärmutter wieder in den Bauch, um die Embryonen warm und geschmiert zu halten. Sofort befeuchten ausgesetzt Gebärmutter mit Kochsalzlösung (vorzugsweise auf Körpertemperatur erwärmt). </li><li> Wenn die Injektion alle Welpen mit dem gleichen Plasmid (wie bei der Injektion Cre-GFP in transgenen Embryos) only entfernen ein Horn des Uterus zu einer Zeit. </li></ol></li><li> Setzen Sie einen geladenen Nadel im Spannkopf der Spritzstab und schneiden Sie vorsichtig die Spitze mit einem Paar von kleinen chirurgischen Schere oder feinen Pinzette. Schneiden Sie die Spitze, so dass die Nadel bleibt so lange wie möglich, während immer noch damit Fluid durch (Abbildung 1ji-iv) übergeben. <ol><li> Verstellbaren Länge der Injektion (in Sekunden) und der Einspritzdruck am Mikroinjektor so daß ein kleines, leicht sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l wird auf der Spitze der Nadel, wenn der Fuß Paddel gedrückt. Halten Sie die Lautstärke dieses Tröpfchen so konsistent wie möglich zwischen verschiedenen Nadeln. Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben Embryo (siehe Diskussion). </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einspritzparameter für den FemtoJet: Injektion Druck (pi) = 250-300 hPa; Einspritzzeit (ti) = 0,8-1,2 sec; Kompensationsdruck = 10 bis 50 hPa. Falls erforderlich, stellen Sie diese Parameter, um Unterschiede zwischen den Nadeln unterzubringen. </li></ol></li><li> Swählt einen Embryo und sanft positionieren Sie es auf dem Rücken, den Kopf nach oben geneigt (1F). HINWEIS: Dies kann erfordern, Drehen oder Verschieben des Embryos; darauf achten, nicht zu viel Druck anwenden und vermeiden Ruptur der Fruchtblase, während die Manipulation des Embryos. </li><li> Sobald der Embryo vorhanden ist, suchen Sie die Herzkammer, die als halbmondförmigen Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Spitze der Nadel in die Gebärmutter über der Herzkammer in einem leichten Winkel und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Der erforderliche Druck hängt von der Schärfe der Nadel. Die Nadel in die Rinde in die Herzkammer. HINWEIS: Auch wenn es selten jede zusätzliche nachweisbar Widerstand, Leiter des Embryos wird oft weg leicht geschoben und dann zurückweicht, wenn die Nadel durch die Rinde in die Herzkammer führt. </li><li> Pumpen Sie den Fuß Paddel, um das Plasmid-Lösung zu injizieren. Weiter zu pumpen, bis ein grüner Bereich sichtbar und entspricht derBogenform des Ventrikels (Figur 1G). In jungen Embryonen (E12.5 bis E14.5) der Farbstoff oft diffundieren in die kontralaterale Ventrikels. HINWEIS: Die Anzahl von Pumpen ist abhängig vom Durchmesser der Nadelspitze, dem Alter des Embryos (und resultierende Größe des Ventrikels) und dem gewünschten Einspritzvolumen. Halten Volumen zwischen Embryonen injiziert so konsistent wie möglich. </li><li> Injizieren drei oder vier Embryonen. Bewahren Sie alle exponierten Embryonen feucht mit Kochsalzlösung im gesamten Verfahren. </li><li> Zurück zu den ersten Embryonen injiziert und legen die Paddel, so daß die positive Elektrode, die das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns (Abbildung 1H) ziehen. Winkel der negativen Elektrode, so dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die Struktur zur Elektroporation gezielte (Abbildung 2). </li><li> Sobald die Paddel sind vorhanden, wenden Sie den Schock. Je nach Alter und Größe des Embryos, nutzen 5 Impulse von 35-50 V (siehe TLage 1). Verwenden Sie die folgenden Elektroporationsparameter: Impulslänge von 5 ms mit einer Impulspause von 950 ms. Wiederholen Sie dies mit allen injizierten Embryonen. </li><li> Schneiden Sie die Spitze der neuen vorinstallierten Nadel, wie in Schritt 3.3 als die letzte Nadel wahrscheinlich, getrocknet und im Schritt 3.9 verstopft. Injizieren Sie die nächste Gruppe von drei oder vier Embryonen entweder mit dem gleichen Plasmid oder einem anderen Plasmid und dann den Schock wie in Schritt 3.9. Wenn alle Welpen in einer Seite der Gebärmutter injiziert werden, entfernen Sie die zweite Seite der Gebärmutter von Bauch des Weibchens und ersetzen Sie dann die fertige Seite, um sie warm zu halten. </li><li> Zurück auf beiden Seiten der Gebärmutter auf die weibliche darauf achten, die Oberfläche feucht mit Kochsalzlösung und nicht zu halten, um zu viel Druck, um Verletzungen der Fruchtblasen zu verhindern. Naht der Muskelschicht geschlossen mit einem einfachen kontinuierlichen Stich. Staple die Haut verschlossen. Wenn Heftklammern nicht verfügbar sind, nähen die Haut mit einer einfachen unterbrochenen Stich. (1I) </li><li> Während suturing, schrittweise reduzieren Sie die Isofluran-Narkose, damit der schwangeren Weibchens zu erhellen. Hinweis: Dies wird Erregung des Dammes zu beschleunigen, nachdem die Operation abgeschlossen ist; Halten des weiblichen für so kurze Zeit wie möglich wird Embryo Überleben verbessern betäubt. Gesamtoperationszeit, ab wann sich der weibliche zunächst betäubt, sollte ca. 30 min. </li></ol> 4. Nachsorge <ol><li> Legen Sie die Naht weiblichen in einem Brutschrank oder auf einem Heizkissen, um aus der Narkose zu erholen. Bed sie auf saubere Bettwäsche und legen Sie ein Standard-Recovery-Gel in den Käfig zu halten Feuchtigkeit. Für die Schmerztherapie nach einer Operation, ergeben die weiblichen drei Dosen von Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) in 8 Stunden Intervallen nach der Operation erhalten die vier zusätzlichen Dosen in 12 Stunden Intervallen. </li></ol> 5. Ernten Brains HINWEIS: Brains kann in jedem Alter bis zum Erwachsenenalter geerntet werden. Es giltzum Sammeln Gehirn vor der Geburt. Beachten Sie, dass einmal Welpen geboren werden, die Reihenfolge in der Gebärmutter ist verloren, also entweder alle Welpen im Wurf mit der gleichen Plasmid injiziert werden, oder ein anderes Verfahren zur Differenzierung zwischen Kontroll- und Versuchstiere müssen entwickelt werden. <ol><li> Bereiten kaltem (4 ° C) und filtriert, 4% Paraformaldehyd (PFA) vor euthanizing weiblich. </li><li> Euthanize das weibliche Verwendung einer intraperitonealen Injektion einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht) und aufgeschnitten Abdomen. Ziehen Sie beide Seiten der Gebärmutter und das Layout wie der Jungtiere zunächst injiziert. <ol><li> In dem Fall, wo alle Jungtiere erhielten die gleiche Plasmid wie beim Injizieren Cre zu einer transgenen Wurf ist Embryo Reihenfolge unwichtig, deshalb schneiden den Uterus aus dem weiblichen und in PBS. </li><li> Bei Jungtieren wurden mit verschiedenen Plasmiden injiziert ist, lesen Sie jeden Welpen zu finden und stellt fest, tote Jungtiere, und festzustellen, welche mit Steuer und experimen injiziert wurdental Plasmiden vor dem Entfernen der Gebärmutter vom Weibchen. Achten Sie darauf, den Überblick zu behalten, welche Welpen zu welcher Gruppe nach der Uterus in PBS. </li></ol></li><li> Nehmen Sie jedes Welpen einzeln, enthaupten mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und legen den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen, sammeln Gewebeproben für die Genotypisierung und halten jeden Kopf getrennt, wie in einer 12-Well-Platte. </li><li> Unter einem Binokular, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, man aufpassen, nicht nick die Rinde oder reißen die Mittellinie. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, prüfen Sie, ob Gehirne haben eine GFP + Patch, was darauf hinweist, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden. </li><li> Fix Gehirn durch Eintauchen in PFA bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Überprüfen Sie Gehirne für die Expression von GFP vor der Fixierung seit PFA oft das Signal löscht. </li><li> Cryoprotect Gehirn durch Eintauchen in 20% Saccharose für mindestens drei Tage vor dem Einfrieren. Verwenden einen Saccharosegradienten von 10%, 15% und 20% (24 h in jeder Lösung) to verhindern Gewebeschädigung durch osmotischen Druck. Bewahren gefrorenen Gehirne bei -80 ° C und auf einem Kryostat geschnitten auf 10-14 um dicke Abschnitte. </li></ol> 6. Co-Färbung mit anti-GFP HINWEIS: Wenn Antigen-Retrieval, um Co-Fleck mit anti-GFP notwendig ist, ist es wichtig, eine schonende Antigen-Retrieval-Protokoll, das die GFP-Signal nicht beeinträchtigt verwenden. Einige Antigen-Retrieval-Protokolle sind zu hart, um in Verbindung mit der GFP-Färbung (sogar mit einem Antikörper gegen GFP) zu verwenden. Eine grundlegende Zitronensäure Vorbehandlung vor dem Aufbringen des primären Antikörpers ist erfolgreich für die meisten Epitope 24. <ol><li> Machen Sie eine 0,01 M Lösung von Zitronensäure in ddH 2 O. pH 6 unter Verwendung eines kalibrierten pH-Meters. </li><li> Wärme Zitronensäure in Färbung Kammer in Mikrowelle oder Wasserbad, bis Zitronensäure erreicht 75 bis 80 ° C. Legen Sie Folien in Färbung Kammer für 10-15 min. Haltetemperatur so stabil wie möglich. </li><li> Waschen Sie Dias in PBS3x für 3 min bei Raumtemperatur. Übernehmen Sie die primären Antikörper und fahren Sie mit Immunfärbung nach einem Standardprotokoll. </li><li> Bestätigen Cre vermittelte Exzision durch Co-Kennzeichnung für GFP und des Gens von Interesse zu bestätigen, knock down (3A). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Zwei der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung in utero Elektroporationen sind 1) verhindert Embryoletalität und 2) abnehmende Variabilität zwischen Elektroporationen. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Vermeidung Letalität ist Nadelqualität, da stumpfe Nadeln verursachen mehr Schaden an dem Embryo. Beim Schneiden der Nadel, halten Sie die Spitze so lange wie möglich während immer noch eine sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l der Flüssigkeit zu erscheinen im Anschluss an eine ...

Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle 1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell 4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration 7,9-11 erforderlich. In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi<html> ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms 12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie 7,9-11, Elektrophysiologie 15 oder Zellkultur 16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System 7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt. IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere 7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom. IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert 17 kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt. Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown. Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine ​​des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen 4,23 und radiale Migration 6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration 6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square Wave Electroporator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>Electroporator only &amp;ndash; buy cables separately (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Footswitch for ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td>Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td></tr><tr><td>Tweezertrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>Platinum forcep style electrodes</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Holds the pulled needle</td></tr><tr><td>Universal Capillary Holder</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Connects griphead to tube</td></tr><tr><td>Injection Tube</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Connects capillary holder to Femtojet</td></tr><tr><td>Foot Control</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Foot paddle for hands-free injection</td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Tips for loading the pulled capillary tubes</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Non-toxic dye</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>For trimming the needles</td></tr><tr><td>Bonn Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Straight</td></tr><tr><td>Colibri Retractors</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Stapler</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>For 7mm clips</td></tr><tr><td>Castroviejo Needle Holder</td><td>Medical Tools</td><td>SNH-6737</td><td>Straight, with lock</td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>For pulling microcappillaries</td></tr><tr><td>Microcapillaries</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td></tr></tbody></table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Genetische Löschen mit Hilfe des Cre-Lox-System in transgenen Mauslinien ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Außer in sehr spezifische Cre-Modelle, Deletion eines Proteins während eines Gewebe- oder Zellpopulation führt häufig zu komplexen Phänotypen aus mehreren zusammenwirkenden Mechanismen resultieren. Bestimmen, ob ein Phänotyp Ergebnisse Störung einer Zelle autonom Mechanismus, der untrennbar mit der betreffenden Zelle, oder von einem nicht-zellautonomen Mechanismus ein, wodurch Beeinträchtigung der Umgebung dieser Zelle führen würde, kann schwer zu erkennen sein. Um einen Einblick in die Proteinfunktion in einem in vivo-Kontext zu ermöglichen, in utero Elektroporation (IUE) ermöglicht Gendeletion in einer kleinen Untergruppe von Zellen innerhalb des Entwicklungsrinde oder einem anderen ausgewählten Hirnregion. IUE können bestimmte Gehirnbereiche, einschließlich der dorsalen Telencephalon, Endhirn medialen, Hippocampus oder Ganglienhügel zielen werden. Dies erleichtert die Beobachtung of die Folgen der Zelle autonom Gendeletion im Rahmen einer gesunden Umwelt. Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, wie IUE können zur Unterscheidung zwischen den Zell autonom und nicht zell autonome Wirkungen von Protein Löschung verwendet werden, um einen Defekt in radiale Migration in einer floxed transgene Mauslinie zu analysieren, mit einem Schwerpunkt. Durch den Vergleich des Phänotyps, die aus Gen-Deletion innerhalb des gesamten Kortex im Vergleich IUE-vermittelte Gen-Deletion in einem begrenzten Zellpopulation, einen besseren Einblick in die Proteinfunktion in der Entwicklung des Gehirns kann als mit beiden Techniken in Isolation erreicht werden.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Induktion der Protein Deletion Durch<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.2K Aufrufe.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Serie: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

Entwicklungsbiologie

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Induktion der Protein Deletion Durch

Zusammenfassung

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