Die Autoren bedanken sich bei Joseph LoTurco und Dennis Selkoe für hilfreiche Diskussionen über diese Technik zu danken. Die Autoren danken den Spendern der American Health Assistance Foundation, für die Unterstützung dieser Forschung.

Das grundlegende Protokoll für die in utero Elektroporation wurde im Detail in einem anderen JoVE Artikel aus der Kriegstein Labor 1, 2 beschrieben. Diese Technik wurde ursprünglich in den Osumi lab 3 beschrieben und unser Protokoll basiert auf einer im LoTurco Lab 4 entwickelt wurde. Wir geben einen Überblick über die unser Protokoll für in utero Elektroporation von Ratte Embryonen, die sich auf die wichtigsten Details, durch eine Beschreibung unseres Protokoll, das in utero Elektroporation gilt für die Untersuchung von Genfunktionen in neuronalen Prozess Auswuchs gefolgt. 1. In utero Elektroporation <ol><li> Vorbereitung DNA und Laden Nadeln Der erste Schritt in utero electroporations ist Ihr Experiment Design zu bestimmen, welche DNA-Konstrukte, die Sie injizieren. Diese Methode ist nützlich für beide misexpressing oder umzuwerfen Gene von Interesse. Wenn Sie auf misexpressing oder Überexpression eines Gens planen, sollten Sie sich auf einen Promotor, der aktiv ist in neuronalen Vorläuferzellen zu verwenden. Wir empfehlen die CAGGS Promotor, die von dem Huhn beta-Aktin-Promotor und dem CMV-Enhancer 5 besteht. Da nur ein kleiner Teil der Zellen transfiziert werden mit in utero Elektroporation, ist es wichtig, ein Plasmid kodierend für ein fluoreszierendes Protein wie GFP enthalten, so dass Sie die Zellen, die erfolgreich elektroporiert wurden, können folgen. Für die Plasmid-Kodierung GFP, empfehlen wir die Vorbereitung der DNA in einer Konzentration von 0,5 pg pro Mikroliter. Für shRNA Konstrukte, haben wir festgestellt, dass 0,5 bis 1,0 pg pro Mikroliter führt zu einer effizienten niederzuschlagen Ihrer Gen von Interesse. Für die Überexpression oder misexpression wir zwischen 1,0 und 3,0 pg pro Mikroliter verwenden, abhängig von der Größe des Gens und die Höhe der Expression, dass das Experiment fordert. DNAs werden unter Verwendung eines Qiagen Endotoxin-freie prep Kit und verdünnt in 1 x PBS. Wir spritzen ca. 0,5-1,0 mL pro embryonalen Gehirn, ja, für einen Wurf von Tieren bereiten wir 10 ul DNA-Gemisch für die Injektion. Wir fügen 1 ul Fast Green an die DNA, so dass wir die injizierte DNA folgen können. Pulling Nadeln in die richtige Form ist ein wichtiger Schritt. Walantus et al. Verwendet ein anderes System für die Bereitstellung der DNA und damit ihre Nadel prep ist auch leicht andere dann unser 1,2. Die Einstellungen, die Sie benutzen, um Ihre Nadeln ziehen wird über die Marke von Nadel-Abzieher, dass Sie abhängig sind. Wir verwenden Modell 750 von David Kopf. Die Einstellungen, die wir verwenden, sind: Heat 1: 9,0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, Filament Größe 3,0 mm, Heizung Proximity: 3 mm, Zeit: 10 sec. Einmal gezogen, schneiden wir unsere Nadeln mit einer Rasierklinge in einem ~ 45 Grad-Winkel, so dass der Abstand von der größten Teil der Öffnung an der Spitze 11 mm ist. Wir laden Sie dann die DNA von dem hinteren Ende der Nadel. Wir füllen dann den verbleibenden Platz in der Nadel mit Maisöl. Für die DNA-Injektion, verwenden wir ein Picospritzer III. Abhängig von der genauen Fase, dass für jede Nadel geschnitten wird, setzen wir die Picospritzer 4,0 bis 6,0. Wir verwenden ein Fußpedal, um die unter Druck stehende Luft, die die DNA verdrängt von der Nadel zu liefern. </li><li> Vorbereitung Tiere für die Chirurgie Wir verwenden pathogenfreien Sprague Dawley Ratten ausschließlich für diese Operationen. Mehrere andere Labore verwenden Mäusen unterschiedlicher Genotypen als auch. Hier beschreiben wir zeigen unsere Protokoll für die Elektroporation von E15 Rattenembryonen, aber in utero Elektroporation wird routinemäßig bei Ratten im Alter zwischen E13 und E18 durchgeführt. Während frühzeitig Elektroporation Ziele tiefen Schichten der Hirnrinde, Ziel später electroporations mehr oberflächlichen Schichten. Tiere sind eine präoperative Dosis von Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) gegeben, bevor die Operation beginnt. Es gibt mehrere Optionen für die Betäubung des Tieres. Walantus et al. Nutzt isofuorane Einatmen, während wir routinemäßig intraperitoneale Injektion von Ketamin (40-80 mg / kg) und Xylazin (5-10 mg / kg) 1,2. Ein Zeh Prise sollte immer durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Tiere völlig betäubt und nicht mehr reagiert werden. Die Tiere sind auf einem Heizkissen während des chirurgischen Eingriffs gehalten. Das Tier das Fell ist in der Region Einschnitt rasiert, gewaschen und dreimal mit Ethanol dreimal mit Jod gefolgt. Ein Schnitt in der Haut nur lateral der Mittellinie, gefolgt von einem Einschnitt in den Muskel. Die Uterushörner sind sehr sorgfältig ausgesetzt. Sie sind vorsichtig aus der Leibeshöhle mit den Fingerspitzen gehänselt. Keep Embryonen hydratisiert mit sterilem PBS, während sie außerhalb der Körperhöhle werden. </li><li> Injektion von DNA und Elektroporation Beim ersten Start der Durchführung dieser Operationen, ist der schwierigste Teil immer mit, wo Sie brauchen, um die DNA zu injizieren, so dass Sie die Seitenventrikel füllen vertraut, und gewöhnungsbedürftig, wie tief Sie spritzen die Nadel, um die richtige Region getroffen. Die Embryonen werden sanft mit den Fingerspitzen so manipuliert, dass sie ident kannIfy wo der Kopf ist, und wenn man genau hinschaut, wird in der Lage sein, die Mittellinie Naht zu sehen. Dies dient als allgemeine Wahrzeichen, die Sie verwenden, um festzustellen, wo die lateralen Ventrikel befindet, kann. Wir injizieren die DNA durch die Gebärmutterwand und in den lateralen Ventrikel. Wir verwenden ein Fußpedal, um die Injektion des DNA-Steuerung - mehrere Impulse von DNA durchgeführt werden, bis die Seitenventrikel mit dem DNA / Farbstoff-Gemisch gefüllt ist. Wir haben dann statt Paddle-Elektroden auf beiden Seiten des Kopfes des Embryos und eine andere Fußpedal, den Puls über den Kopf des Embryos liefern. Die Platzierung der Elektroden ist entscheidend dafür, in welcher Region der Großhirnrinde ist elektroporiert. Da die DNA negativ geladen ist, wird die DNA in Richtung der positiven Elektrode, wenn eine Ladung über die Paddel ist gebannt zu reisen. Abhängig von der exakten Platzierung der Elektroden werden verschiedene Untergruppen von Zellen ausgerichtet werden. Wir routinemäßig statt der positiven Elektrode in der Nähe der dorsal-medialen Positionen in das Großhirn. Doch die LoTurco Labor schön gezeigt, dass, wenn Sie die Elektroden in mehr ventralen seitlichen Bereiche des Großhirns Stelle können Sie die Zellen des kortikalen-striatalen Grenze und traf Zellen des lateralen kortikalen Strom 6 Ziel. Jeder Embryo kann elektroporiert werden, und verschiedene Kombinationen von DNA-Konstrukte können in jedem Embryo verwendet werden. </li><li> Naht-und post-operative Betreuung Nach Elektroporation von Tieren alle Embryonen, die Uterushörner sorgfältig in die Leibeshöhle zurück, und sowohl die Muskelschicht und die Haut vernäht. Die Technik dafür ist in Walantus et al 1,2 skizziert. Die Tiere werden kontinuierlich, bis sie wieder aus der Narkose überwacht, und die analgetische Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) wird alle 8-12 Stunden verabreicht. </li></ol> 2. Die Kultivierung elektroporiertem kortikalen Neuronen <ol><li> Harvesting elektroporiert Gehirn und seziert elektroporiert Region Für die in vivo-Analysen nach in utero Elektroporation, Tiere können zu jedem Zeitpunkt von 24 Stunden nach der Elektroporation zu früh nach der Geburt bis zum Erwachsenenalter geerntet. Allerdings, wenn Kultivierung primärer Neuronen ernten wir 24 Stunden nach der Elektroporation bei E16. Zu diesem Zeitpunkt sind die Elektroporation Embryonen zum Ausdruck nachweisbaren Mengen von GFP. Die Tiere werden eingeschläfert unter Verwendung von Kohlendioxid beim Einatmen und schnellen Enthauptung. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter präpariert und in HBSS mit zweiwertigen Kationen, die Verfolgung von Embryonen mit dem DNA-Plasmide wurden durch Elektroporation. Es ist wichtig, gefiltert HBSS, sterilen Röhrchen und Platten, und autoklaviert Tools für die Präparation zu verwenden. Die Rinden werden und seziert die Hirnhäute entfernt mit Hilfe eines Mikroskops in eine Kapuze. Diese Rinden werden dann unter einem Binokular mit einer Kapazität von GFP visualisieren beobachtet. GFP positive Regionen der Hirnrinde werden identifiziert, und wir ue ein Paar vanna Schere zum Ausschneiden der GFP positive Regionen der Hirnrinde. Diese Stücke sind in HBSS ohne zweiwertige Kationen in einem 15 ml konischen Röhrchen gegeben. </li><li> Distanziert und Galvanisieren Neuronen Sobald alle GFP positive Regionen seziert werden, ist HBSS mit 0,25% Trypsin abgelöst, und bei 37 Grad für 5 Minuten. Trypsin ist entfernt, ersetzt mit plating Medien (DMEM + 5% FBS + Penn / Strep + Glutamin) gut vermischt und 5-7 mal, um die Zellen zu distanzieren. Volumes verwendet, auf die Menge an Gewebe vorhanden abhängen. Dissoziierten Zellen werden dann auf CC2 beschichtete Kammer-Objektträgern ausgestrichen. Für Zwei-Kammer-Objektträger, Platte wir 200,000-350,000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 1,5 ml Plating Medien. Nach 4 Stunden ist plating Medien abgesaugt und durch 1,5 ml Neuronale Kulturmedien (Neurobasal media + B27 ergänzen + Glutamax + Gentamycin) pro Kammer. </li></ol> 3. Analyse neuronaler Prozess Outgrowth <ol><li> Fixierung und Immunfärbung Kulturen Um kurzfristig Wirkungsforschung der genetischen Manipulation dieser Zellen zu messen, ernten wir die primären Neuronen nach drei Tagen in vitro. Wenn primären Neuronen länger für weitere Analysen kultiviert werden, sollte die Hälfte der Medien jeder ersetzt werden drei Tage. Für die Befestigung Kulturen, absaugen wir die Medien aus den Kammern, und befestigen Sie die Neuronen in 4% paraformaldhyde für 15 Minuten. Nach der Fixierung werden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und dann in Blocking-Lösung (2% Esel-Serum mit 0,1% Triton X-100 in PBS) für 1 Stunde. Gesetzt Die Zellen werden dann in Primärantikörper für 1 Stunde inkubiert. Für Analysen der neuronalen Prozess Auswuchs, nutzen wir Anti-beta tubululin Antikörper an Neuronen zu identifizieren - beta II Tubulin-Immunfärbung Etiketten der neruonal Zellkörper, Dendriten und Axone. Die Zellen werden dann dreimal in PBS für 5 Minuten gewaschen und anschließend in Cy3-anti-Maus für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von drei weiteren PBS gewaschen, Gegenfärbung Kerne mit DAPI und Montage. </li><li> Mess-neurite Länge Bilder von GFP positive, beta-Tubulin-III positive Neuronen sind auf einem Zeiss Axioskop mit einer MC100 Kamera-System erworben. Mehrere Variablen in dieser GFP-positiven Zellen einschließlich der Länge aller Neuriten, Länge des längsten Neuriten untersucht werden können, Verzweigung von Neuriten, die Größe der Zelle soma, etc. Wir haben diese Methode verwendet, um neuronale Prozess Auswuchs auf knock down oder Überexpression von Genen zu analysieren in Bezug auf die Entwicklung des Nervensystems und Neurodegeneration, mit einem Schwerpunkt auf neuronalen Prozess Länge. Um neuronale Prozesse Auswuchs zu messen, verwenden wir AxioVision LE 4.4 Software (Fa. Zeiss). Innerhalb dieser Software gibt es eine Option, die &quot;Skizze&quot; Werkzeug auswählen. Mit diesem Tool können Sie Ihre Computer-Maus, um die Länge der einzelnen neuronalen Prozess zu verfolgen. Es ist entscheidend, um das Ziel, dass Sie in Ordnung sind, um ein genaues Maß für Ihre Neuriten bekommen definieren. Für diese Analysen verwenden wir typischerweise eine 20x-Objektiv. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wir haben festgestellt, dass Sprague Dawley Wurfgröße zwischen 6 und 14 Embryonen reicht. Wir in der Regel elektroporieren alle Embryonen. Jeder Embryo kann mit einer unterschiedlichen Kombination von DNAs elektroporiert werden. Allerdings haben wir in der Regel elektroporieren mindestens vier Gehirne mit den gleichen Zustand und Pool dieser Gehirne vor distanziert und Galvanisieren. Wir haben festgestellt, dass mit dieser Technik etwa 75% der Elektroporation Gehirn auf die gewünschte Region des Kortex ausgerichtet sind, ob dieser dorsalen medialen oder ventralen lateralen Kortex (Abbildung 1). Darüber hinaus haben wir früh electroporations bei E13-14 Ziel-tiefe Schicht Neuronen wie Tbr1 positive Schicht VI Neuronen gefunden, während später electroporations Ziel CTIP2 positive, TBR1 negativen Schicht V-Zellen, und noch später electroporations Ziel Brn2 positive Schicht II / III-Zellen. Eine ausgezeichnete Beschreibung der verschiedenen Marker und Erklärung der neuronalen Subtyp Spezifikation in der Hirnrinde in einen Artikel gefunden, durch Moleneaux et al 7. Abbildung 2 zeigt koronalen Abschnitte des Gehirns entweder Embryonaltag 15,5 oder 17,5 elektroporiert und geerntet postnatalen Tag 5. Rot dargestellt ist Oct6 Immunfärbung. Sie können für Marker in Kultur immunostain zu bestätigen, was Zellschicht Populationen Sie gezielt. Wir haben festgestellt, dass man erwarten, dass die gleichen Zellschicht Population von Zellen in jeder Embryo aus dem gleichen Wurf Ziel (in anderen Worten hängt die Ausrichtung auf die embryonale Zeitpunkt eher dann auf anderen technischen Varianten). In Kultur kann der prozentuale Anteil der Zellen, die GFP-positiv sind sehr vielseitig, je nachdem wie konservativ Sie sind, wenn sezieren die GFP positiven Bereich (Abb. 3). Aber auch wenn wir sehr konservativ sind und sezieren nur die GFP positive Patch von Zellen, den höchsten Anteil, die wir beobachten ist 5-10% - obwohl Sie sezieren die Region der Großhirnrinde, das war elektroporiert sind, werden die Zellen in nur einer Schicht werden angestrebt. Diese geringe Transfektionseffizienz effciency ist hilfreich bei der Ermittlung, welche Prozesse die electoporated Zelle, die Sie analysieren gehören. Plating-Zellen bei dieser höheren Dichte trägt mit heathier Kulturen, jedoch ist es schwierig zu erkennen, welche Prozess gehört die Zellkörper in die GFP-negativen Zellen (Abbildung 3). Wenn Sie Probleme sehen alle die feinen Prozesse der elektroporierten Zellen haben, können Sie entweder eine Erhöhung der Konzentration von GFP DNA, dass Sie Elektroporation, um die Expression von GFP zu erhöhen, oder Sie können die dissoziierten Zellen immunostain mit einem Anti-GFP-Antikörper (Fa. Invitrogen ) zusammen mit einem Cy2 sekundären Antikörper. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. E15.5 Sprague-Dawley Ratten wurden mit GFP-Plasmid elektroporiert und geerntet drei Tage später. Basierend auf der Platzierung der Elektroden werden verschiedene Regionen des Kortex ausgerichtet sein. AF zeigen GFP-Fluoreszenz in ganzen Gehirn. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. E15.5 (A) oder E17.5 (B) Sprague-Dawley Ratten wurden mit GFP-Plasmid und die Ernte bei postnatalen Tag 5 elektroporiert. Die Gehirne wurden fixiert, geschnitten koronal mit einem Vibratom (100 micron Abschnitte) und immunhistochemisch für Oct6 (rot). A und B zeigen konfokale Bilder von immungefärbt Abschnitten. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. E15.5 Sprague-Dawley Ratten wurden mit GFP-Plasmid elektroporiert. 24 Stunden nach der Elektroporation wurden Gehirne entnommen und GFP-positive, elektroporiert Regionen wurden seziert und distanziert, wie in dem Video beschrieben. Nach 3 Tagen in vitro wurden die Zellen fixiert und BIII-Tubulin (rot) immungefärbt und Kernfärbung mit DAPI (blau) (A, C). Die Länge des längsten Neuriten wurde mit der Software AxioVision(B, D).

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglichen quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs beeinflussen können shRNA oder misexpression Konstrukte in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen M...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglicht quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs, shRNA-oder cDNA-Konstrukte können in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden beeinträchtigt. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen Methoden. Die Verwendung von in utero Elektroporation DNA-Konstrukte in der embryonalen Nagetier Kortex vorstellen können für bestimmte Untergruppen von Zellen gezielt zu: Während die Elektroporation von frühen embryonalen Kortex Ziele tiefen Schichten der Hirnrinde, Ziele Elektroporation am späten embryonalen Zeitpunkten mehr oberflächlichen Schichten. Darüber hinaus Differential Platzierung der Elektroden über die Köpfe der einzelnen Embryonen Ergebnisse in der Ausrichtung der dorsal-medial gegen ventral-lateralen Regionen des Kortex. Nach der Elektroporation können transfizierte Zellen aus zerlegt werden, dissoziiert und vernickelt in vitro für die quantitative Analyse von Neuriten. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur quantitativen Messung neuronaler Prozess Auswuchs in Teilmengen von kortikalen Zellen. Das grundlegende Protokoll für die in utero Elektroporation wurde im Detail in zwei anderen JoVE Artikel aus dem Kriegstein Labor 1, 2 beschrieben. Wir geben einen Überblick über unser Protokoll für in utero Elektroporation, die sich auf die wichtigsten Details, durch eine Beschreibung unseres Protokoll, das in utero Elektroporation gilt für die Untersuchung von Genfunktionen in neuronalen Prozess Auswuchs gefolgt.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.7K Aufrufe.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

Serie: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...