Unterstützung der Zuschüsse EB007279 und HL081273 von der NIH USA gedankt.

1. Allgemeine Beschreibung der Sauerstoff Messprotokoll (Dieser Abschnitt hat keine Wirkung, ist aber von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Rest des Papiers. Es gefilmt kann zum Beispiel sein, als eine Folge von ein paar Power Point Folien, begleitet von der Stimme.) 1,1) Die Sonde in das Medium von Interesse geliefert wird, zum Beispiel im Blut oder interstitielle Flüssigkeit eines Tieres injiziert. 1,2) Das Objekt (Oberfläche des Gewebes) ist mit dem Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um die Sonde in den angeregten Triplett-Zustand zu fördern. Typischerweise Anregung erfolgt über die Ein-Photonen-Mechanismus. Doch im Fall von speziellen Zwei-Photonen-enhanced-Sonden kann die Anregung über die Zwei-Photonen-Mechanismus, der mit den Sonden in der hochauflösenden Mikroskopie-Anwendungen ermöglicht erfolgen. Ein-Photonen-Anregung generell weniger räumliche Auflösung, erfordert aber einfacher Instrumentierung und können in Ein-Punkt-Messungen mit LED-basierten Glasfaser-phosphorometers verwendet werden. 1,3) Phosphoreszenz von der Sonde emittierten stammt aus dem langlebigen Triplett-Zustand. Die Sondenmolekül müssen speziell ausgelegt werden, um hohe Quantenausbeute der Triplett-Zustand geben und emittieren Phosphoreszenz statt Fluoreszenz. Während in den Triplett-Zustand, kann die Sonde collisional Begegnungen mit Sauerstoffmoleküle, die de-aktivieren Sie die Triplett-Zustand erleben können - &quot;. Abschrecken&quot; einen Prozess namens In Abwesenheit von Sauerstoff, die Lebensdauer des Triplett-Zustand, und damit der Phosphoreszenz Verfall, ist τ 0. In Anwesenheit von Sauerstoff wird die Phosphoreszenz Lebensdauer (τ) als Folge der Löschung verkürzt. Es gibt eine direkte Beziehung zwischen der Lebensdauer des Triplett-Zustand und die Menge an Sauerstoff in die Umwelt. Dies ist der bekannte Stern-Volmer-Beziehung, die die Lebensdauer (τ) der Phosphoreszenz verbindet Sauerstoffkonzentration [O 2] (oder Sauerstoff-Partialdruck pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Gleichung" /> In biologischen Systemen ist Sauerstoff bei weitem die effektivste Quencher der Phosphoreszenz, die die Phosphoreszenz Abschreckverfahren sehr selektiv zu Sauerstoff macht. 1,4) Um die Lebensdauer t zu messen, werden die emittierten Photonen in phosphoreszierenden Zeit binned. Zum Beispiel, nach dem Anregungspuls, vielleicht 200 Photonen in den ersten 15 Mikrosekunden erfasst werden, 150 Photonen in den nächsten 15 Mikrosekunden gesammelt, und so weiter, bis keine Photonen gesammelt werden. Die Zahlen in den Behälter gegen die Zeit aufgetragen geben die Phosphoreszenz Fäulnis, die analysiert werden, um die Lebensdauer τ Ausbeute ist. In Bildgebung, ist dieses Verfahren in jedem Pixel des Bildes angewendet, was zu Phosphoreszenz Lebensdauer Karten. Messungen der Lebensdauer sind unempfindlich gegen die Heterogenitäten der Sonde Verteilung über das Objekt, das gemeinsam für biologische Proben ist. So berichten Lebenszeiten nur auf Sauerstoff. Lifetimes τ sind in Sauerstoff-Konzentrationen mit der Stern-Volmer-Beziehung umgewandelt. 2. Bau von phosphoreszierenden Sonden Phosphorescent Sonden für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen bestehen aus phosphoreszierenden Chromophore (Kerne), in Käfige von Dendrimeren aufgebaut gekapselt - sehr regelmäßigen hyperverzweigten Polymeren [3]. Dendrimere schützen die Kerne von Wechselwirkungen mit der Umwelt und die Kontrolle der Geschwindigkeit der Sauerstoff-Diffusion an die Kerne, die es ermöglicht, die Empfindlichkeit und Dynamik der Sonden (k q in der Stern-Volmer-Beziehung) zu optimieren. Die Termini der Dendrimere sind mit chemisch inerten hydrophilen Polyethylenglykol (PEG) modifiziert, so dass die Sonden hoch wasserlöslich und verhindert deren Wechselwirkungen mit biologischen Makromolekülen. Phosphorescent Kerne der Sonden sind Pt-oder Pd-Komplexe von Porphyrinen und π-erweiterten Porphyrine. π-Extended Porphyrine Porphyrine in die Pyrrolringe mit externen aromatischen Fragmenten fusioniert sind. π-Extension ermöglicht Abstimmung der Sonden spektroskopischen Eigenschaften an die Anforderungen eines bestimmten Imaging-Anwendung (z. B. Mikroskopie vs Tomographie) zu befriedigen. Als Beispiel beschreiben wir Synthese von Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP ist über leistungsfähige Absorptionsbanden im fernen roten Teil des Spektrums und starke Phosphoreszenz, auch für die biologische Sauerstoff-Messungen geeignet. Die Synthese von PdAr 4 TBP ist besteht aus folgenden Schritten: 2,1) Vorbereitung der tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) von Lindsey Kondensation [5] tetrahydroisoindole mit substituierten Benzaldehyden. Um eine 0,01 M Lösung von tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 Cl 2 der aromatischen Aldehyd (1 eq) wurde unter Argon zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 10 min im Dunkeln bei RT BF 3 XET 2 O (0,2 eq) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für weitere 2 h gerührt DDQ (1 eq) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht unter ständigem Rühren gelassen. Die Lösung wurde mit 10% aq Na 2 SO 3 gewaschen, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq. HCl und schließlich mit Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet, dann im Vakuum konzentriert. Tert-Butyl-Ether-Mischung zu geben, Ar 4 TChP als grünes Pulver - Der Rückstand wurde aus CH 2 Cl 2 umkristallisiert. Die Erträge sind etwa 50%. 2,2) Insertion von Pd zu erhalten PdAr 4 TCHPs. Free-Basis Porphyrine (1 eq) wurden mit PdCl 2 oder Pd (OAc) 2 (1.2 eq) in siedendem CH 3 CN in Gegenwart eines Überschusses von Et 3 N (20 eq) behandelt. Der Umsatz wurde durch UV-Vis-Spektroskopie überwacht (Lösungsmittel CH 2 Cl 2-AcOH) und als abgeschlossen, nachdem die Soret-Bande von Diktaten auf 468-472 nm verschwunden. Die Mischung ließ man abkühlen, verdünnt mit CH 2 Cl 2 und durch eine dünne Schicht von Celite auf Pd (0) zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit CH 2 Cl 2 als Lösungsmittel gereinigt. Dunkelrot Fraktion gesammelt wurde, wurde das Lösungsmittel verdampft, um Ziel-PdAr 4 TCHPs in nahezu quantitativer Ausbeute. 2,3) PdAr 4 TBP Jahre waren durch Oxidation von PdAr 4 TCHPs mit dem 2-fachen Überschuss von DDQ (16 eq) in THF unter Rückfluss erhitzt vorbereitet. Während siedendem, änderte sich die Farbe von dunkel-rot bis tief-grün. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, der Rückstand mit CH 2 Cl 2 verdünnt, mit 10% aq Na 2 SO 3, Wasser und Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel CH 2 Cl 2) gereinigt. Die erste dunkelgrüne Fraktion wurde gesammelt, konzentriert im Vakuum auf 85-90% der als blau-grünes Pulver PdAr4TBP ist zu geben. 2,4) Peripheral Estergruppen Pd Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-Tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) wurden hydrolysiert mit 10-facher Überschuss an KOH in 1% (v / v) Wasser / THF bei RT. Das Lösungsmittel wurde aus dem Niederschlag des gebildeten Kaliumsalze von Carbonsäurederivaten PdAr4TBP ist dekantiert. Die Feststoffe wurden in Wasser gelöst, gerührt für weitere 2 h, mit konz. HCl auf pH ~ 4-5. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Schützen Dendronen. Jeder einzelne Zweig der Dendrimer heißt dendron. Schützen Dendrone sind aus Aryl-Glycin (AG) Bausteinen aufgebaut. AG Dendrone kann leicht aus billigen Ausgangsstoffen synthetisiert und isoliert werden in hoher Reinheit und Ausbeute durch Chromatographie-free-Methoden. Synthese von Generation 2 (G2) AG-dendron besteht aus folgenden Schritten: 2,4) Synthese der Bausteine, Boc-geschützte 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide und 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, mit der Fischer Haloacyl Halogen-Methode. 2,5)-Kupplung der Bausteine ​​mit CDMT / NMM Peptidkopplung Chemie. 2,6) Entschützen der Schwerpunkt Aminogruppe durch Rühren der Lösung der G2 dendron in TFA 2 h bei RT 2,7) Für die Montage der höheren Generation Dendrone sind Kupplung / Entschützung Schritte wiederholt. Dendrimer Montage ist durch die Kopplung des entschützten Dendronen PdAr4TBP (oder andere Porphyrin) mit dem HBTU / DIPEA Kopplungschemie erreicht. 2,8) werden zunächst die Boc-Schutzgruppen aus den dendron entfernt. Zum Beispiel wurde Boc-geschützten G3 dendron (0,58 g) in TFA (15 ml) gelöst und die Mischung wurde bei RT 2h reagieren. Die Säure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, was die dendron als TFA-Salz. Der Rückstand wurde in trockenem NMP (10 ml) gelöst und ein paar Tropfen DIPEA wurden hinzugefügt, um die Spuren von TFA zu stillen. 2,9) Vor Beginn der Kupplungsreaktion ist es entscheidend, um sich vollständig aufzulösen Porphyrin. So wurde zum Beispiel Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) in trockenem NMP (65 ml) unter Erhitzen auf 140 ° C gelöst für 10 min unter Stickstoff strömen. 2,10) Die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wurde HBTU (0,211 g) zugegeben und das Gemisch wurde für 5 min gerührt. 2,11) DIPEA (0,35 ml) wurde zu dem Gemisch in einer Portion zugegeben, unmittelbar gefolgt von der Zugabe des Lö gefolgtauf der TFA-Salz der dendron in NMP (siehe 2,8), und die Mischung wurde über Nacht unter Rühren. 2,12) Das Gemisch wurde in 3% aq gegossen. NaCl (350 ml), und der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und mit Wasser gewaschen, MeOH und Et 2 O durch wiederholte Aussetzung / Zentrifugation, um das Ziel Porphyrin-Dendrimer erhalten. 2,13) ​​zu den peripheren Estergruppen hydrolysieren, wurde das Dendrimer zuerst mit NMe 4 OH (~ 5 mM) in DMSO / MeOH über 20-60 min Dauer, durch die vollständige Entfernung des Lösungsmittels behandelt, gefolgt. Dieses Verfahren erlaubt es uns, Dendrimere mit ausreichenden Zahl von Carboxylatgruppen zu Wasserlöslichkeit geben zu generieren. Zur Vervollständigung der Hydrolyse wurde das Dendrimer mit 0,1 N wässriger NaOH (overnight) behandelt. Als Ergebnis konnte rein Porphyrin-Dendrimer-Carbonsäuren in 80-95% Ausbeute isoliert werden. Änderung der Dendrimer-Peripherie. An dieser Stelle, ausgehend von der gleichen Porphyrin-Dendrimer, entweder ein-oder Zwei-Photonen-Sonden synthetisiert werden können. Im ersten Fall werden alle peripheren Carboxylgruppen mit PEG-Einheiten verändert - eine Methode, wie PEGylierung bekannt. Im letzteren Fall sind mehrere Carboxylgruppen zunächst mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore (Cumarin-343) modifiziert mit Ethylendiamin (EDA)-Linker, gefolgt von PEGylierung der verbleibenden Carboxylgruppen [6]. Gekoppelt Dendrimere wurden PEGylierte mit monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) mit HBTU / DIPEA Kopplungschemie. 2,14) Zu einer Lösung des dendron in NMP (oder DMF) (1-10 mM) 1,25-fachen Überschuss von HBTU zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei RT für 10 min gerührt. 6,25-fachen Überschuss von DIPEA zugegeben, gefolgt von der sofortigen Zugabe von 1,25-fachen Überschuss von m-PEG-NH2. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage bei RT gerührt. Diethylether zur Reaktionsmischung zugegeben wurde, wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation und wieder ausgefällt aus THF durch Zugabe von Diethylether getrennt. 2,15) Endreinigung wurde mit Größenausschlusschromatographie durch das Sammeln der ersten Front Phase erreicht. PEGylierte Porphyrin-Dendrimer wurde in einer kleinen Menge THF (~ 15 ml) gelöst und auf der Oberseite eine Chromatographiesäule mit Polystyrol SEC Phase (Biorad, Biobeads S-X1) gefüllt. Die Säule wurde mit reinem THF eluiert und die dunkle Band bewegt sich mit der Front gesammelt wurde. 2,16) THF wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das verbleibende Material wurde im Vakuum getrocknet. 3. Probe Charakterisierung Photophysikalische Charakterisierung umfasst Messungen der Sonde Absorptions-und Emissionsspektren, Phosphoreszenz Lebensdauer τ 0 und Stern-Volmer-Sauerstoff-Konstanten k q unter physiologischen Bedingungen. 3,1) Die Absorptions-und Emissionsspektren sind unter Umgebungsbedingungen mit Standard-Instrumentierung (Spektralphotometer und stetige Fluorometer) erhalten. ~ 1 uM Lösungen der Sonde verwendet wird. 3,2) Als nächstes wird der Stern-Volmer Eichkurve erhalten. Dies ist die wichtigste Messung, weil es uns um die Lebensdauer der Sonde auf die Sauerstoffkonzentration beziehen können. 3,3) eine Lösung der Sonde in PBS-Puffer (pH 7,2) wird in einem speziellen zylindrischen Küvette, die innerhalb der temperierten Kammer positioniert ist, in einem lichtundurchlässigen Käfig mit Anschlüssen für Anregung und Emission optischer Fasern platziert. Die Fasern werden in engen Kontakt mit der Küvette im Inneren der Kammer in den rechten Winkel Geometrie gebracht. 3,4) Die Küvette wird mit einem Stopfen verschlossen, in die ein hochempfindliches Clark-Typ Sauerstoffelektrode (CK-Sauerstoff-Elektrode) eingefügt wird. Der Stopfen enthält auch zwei Nadel-Anschlüsse für Ein-und Austritt von Argon. Die Elektrode wird in die Lösung eingetaucht, während die Nadeln nur für die Strömung des Gases fließen über der Lösung Oberfläche zu versehen. Zunächst wird Argon nicht mit dem Einlass verbunden. 3,5) wird die Temperatur auf den gewünschten Wert (in der Regel 36-37 ° C) eingestellt und die Lösung wird unter Rühren zur Äquilibrierung links. 3,6) Die Anregung Faser ist die Anregung Anschluss eines digitalen phosphorometer, von einem PC betrieben wird. Die Lichtquelle in der phosphorometer ist ein High-Power-LED, deren Ausgang wird durch einen 333 kHz D / A-Board gesteuert. Die Emission Faser ist eine andere optische Schnittstelle des phosphorometer, was zu einer stark IR-empfindliche APD (Avalanche-Fotodiode) gekoppelt ist. Der Ausgang der Diode wird verstärkt und in die A / D-Kanal der gleichen Steuerkarte, die Synchronisation zwischen dem Anregungs-und Emissions-Kanälen ermöglicht. 3,7) Die Steuerungssoftware alTiefs Generation von Anregungspulsen beliebiger Länge (zB 5 oder 10 ms), durch Sammlung von Phosphoreszenz Zerfall während einer willkürlich gewählten Zeitraum (typischerweise 2-3 ms) gefolgt. Zeit für ein einziges Leben Messung erforderlich ist typischerweise 0.5-1 s, jedoch können die Messungen so schnell wie 10-20 pro Sekunde erreicht werden. 3,8) Die Ausgabe der Sauerstoff-Elektrode wird verstärkt und in ein anderes A / D Board gerichtet auf dem gleichen PC. Dies ist eine niedrige Frequenz Bord (1 kHz max), die verwendet werden, um die Elektrode Strom bei ausgewählten Zeiträumen Datensatz. Das Programm für die Aufnahme der Elektrode Daten läuft gleichzeitig mit dem phosphorometer Software. 3,9) Sobald die Temperatur der Lösung ist äquilibriert werden sowohl die phosphorometer und die Elektrode Programme gleichzeitig initialisiert führen Messungen alle 10 s. Deren Ausgänge werden synchron in zwei separaten Dateien protokolliert. Danach wird Argon zu der Einlassöffnung auf der Küvette Stopfen verbunden. 3,10) Wie Argon strömt über die Oberfläche des gerührten Lösung, es ersetzt allmählich Sauerstoff. Dies führt zu einer Abnahme der Elektrode Strom und eine Erhöhung der Phosphoreszenz Lebensdauer, die durch die phosphorometer gemessen wird. Normalerweise wird der Sauerstoff verdrängt bilden die Lösung ganz nach ca. 2 h, während welcher Zeit die Daten vollständig automatisch in Dateien protokolliert. 3,11) Nach dem Ende der Titration ausführen, werden die Elektroden-Daten und die Phosphoreszenz Lebzeiten in eine Standard-Analyse-Programm (zB Miocrocal Origin) importiert. Die Elektrode aktuellen hängt linear von der Sauerstoffkonzentration, und für die Elektrode verwendet, ist es praktisch Null auf Null Sauerstoff. Bei Atmosphärendruck ist pO 2 bekannt (etwa 150 mm Hg). So kann die Elektrode direkt an den Sauerstoff Skala umgewandelt werden, und die Handlung der inversen Phosphoreszenz Lebensdauer vs pO 2 konstruiert werden kann. Dieses Grundstück ist mit einer geraden Linie mit der Methode der kleinsten Quadrate, um den Sauerstoff Abschrecken konstant kq wie seine Neigung zu geben ausgestattet. Phosphoreszenz Lebensdauer t0 wird entweder aus dem gleichen Ausrichtung (wie die Umkehrung der Intercept) oder direkt aus der Messung bei Null-Sauerstoff erhalten. 3,12) Falls erforderlich, die Titration wiederholt wird, indem eine Lösung der Sonde in Gegenwart von Albumin - ein Protein, das in das Blutplasma in hohen Konzentrationen - in, um die Bedingungen zu emulieren trafen sich in der realen experimentellen System (Blut eines Tieres in vivo). Die erhalten Stern-Volmer Plots sollten identisch sein, wenn das Dendrimer ist der Schutz der Sonde gut und PEG-Gruppen zu isolieren die Sonde von Kontakten mit Albumin. Andernfalls wird die Sonde und der Proteine ​​im Blut interagieren, und das wird zu einer veränderten Stern-Volmer Plot führen, daß eine Doppeldeutigkeit in Sauerstoff-Messungen. So erhalten Kalibrierkonstanten sind in bildgebenden Experimenten, bei denen der Sauerstoff-Konzentrationen sind a priori unbekannt verwendet.

<ol>
	<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems.">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li><li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins.">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li><li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited:+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions.">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li><li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen.">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li></ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abkürzung</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vollständiger Name</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-Methylpyrrolidinon</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifluoressigsäure</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamin</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsulfoxid</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-Chlor-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Sauerstoff-Messung durch Phosphoreszenz Abschrecken [1, 2] besteht aus folgenden Schritten: 1) wird die Sonde in das Medium von Interesse (zB Blut oder interstitielle Flüssigkeit) geliefert, 2) das Objekt wird mit Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um zu begeistern die Sonde in die Triplett-Zustand, 3) die emittierte Phosphoreszenz gesammelt, und ihr zeitlicher Verlauf wird analysiert, um die Phosphoreszenz Lebensdauer, die in die Sauerstoff-Konzentration (oder Partialdruck pO umgewandelt wird Ertrag<sub&gt; 2</sub&gt;). Die Sonde muss nicht mit der biologischen Umgebung interagiert und in einigen Fällen bis 4 sein) ausgeschieden aus dem Medium auf der Messung der Fertigstellung. Jeder dieser Schritte stellt Anforderungen an das molekulare Design von den phosphoreszierenden Sonden, die die einzige invasive Komponente des Messprotokolls darstellen. Hier beschreiben wir das Design von dendritischen phosphoreszierende Nanosensoren für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen. Die Sonden bestehen aus Pt oder Pd-Porphyrin-basierte polyarylglycine (AG)-Dendrimere, peripher mit Polyethylenglykol (PEG)-Reste modifiziert. Für eine effektive Zwei-Photonen-Anregung kann Termini der Dendrimere mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore, die die Anregungsenergie einzufangen und leiten es in den Triplett-Kerne der Sonden über intramolekulare FRET (Förster Resonance Energy Transfer) geändert werden. Wir beschreiben die wichtigsten photophysikalischen Eigenschaften der Sonden und präsentieren detaillierte Kalibrierprotokolle.

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Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Serie: Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
neuro-metabolic-vascular relationship. Development of new pO2 measurement modalities with simultaneous monitoring of pO2 in larger fields of view with higher 
spatial and/or temporal resolution will enable greater insight into the functioning of the normal brain and will also have significant impact on diagnosis 
and treatment of neurovascular diseases such as stroke, Alzheimer's disease, and head injury.
Optical imaging modalities have shown a great potential to provide high spatiotemporal resolution and quantitative imaging of pO2 based on hemoglobin absorption in visible and near infrared range of optical spectrum. However, multispectral measurement of cerebral blood oxygenation relies on photon migration through the highly scattering brain tissue. Estimation and modeling of tissue optical parameters, which may undergo dynamic changes during the experiment, is typically required for accurate estimation of blood oxygenation. On the other hand, estimation of the partial pressure of oxygen (pO2) based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence should not be significantly affected by the changes in the optical parameters of the tissue and provides an absolute measure of pO2. Experimental systems that utilize oxygen-sensitive dyes have been demonstrated in in vivo studies of the perfused tissue as well as for monitoring the oxygen content in tissue cultures, showing that phosphorescence quenching is a potent technology capable of accurate oxygen imaging in the physiological pO2 range. 
Here we demonstrate with two different imaging modalities how to perform measurement of pO2 in cortical vasculature based on phosphorescence lifetime imaging. In first demonstration we present wide field of view imaging of pO2 at the cortical surface of a rat. This imaging modality has relatively simple experimental setup based on a CCD camera and a pulsed green laser. An example of monitoring the cortical spreading depression based on phosphorescence lifetime of Oxyphor R3 dye was presented. In second demonstration we present a high resolution two-photon pO2 imaging in cortical micro vasculature of a mouse. The experimental setup includes a custom built 2-photon microscope with femtosecond laser, electro-optic modulator, and photon-counting photo multiplier tube. We present an example of imaging the pO2 heterogeneity in the cortical microvasculature including capillaries, using a novel PtP-C343 dye with enhanced 2-photon excitation cross section.
Click here to view the related article <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/Details.php?ID=1731">Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a>

We present an experimental procedure for measuring the partial pressure of oxygen (pO2) in cerebral vasculature based on oxygen-dependent quenching of phosphorescence. Animal preparation and imaging procedures were outlined for both large field of view CCD-based imaging of pO2 in rats and 2-photon excitation based imaging of pO2 in mice.

Cerebral Blutoxygenierung Messung auf Sauerstoff-abhängige Quenching der Phosphoreszenz Based

Monitoring of the spatiotemporal characteristics of cerebral blood and tissue oxygenation is crucial for better understanding of the 
...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Biotechnik

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Immunologie und Infektion

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Zeitaufgelöste photophysikalischen Charakterisierung der Triplett-Ernte organische Verbindungen in einer sauerstofffreien Umgebung verwenden eine iCCD Kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Chemie

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Biologie

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...