Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem CIHR und der NSERC of Canada unterstützt. VIT ist ein CIHR New Investigator und Concordia University Research Chair in Genomics, Cell Biology and Aging.

Material und Methoden Hefestämme und Wachstumsbedingungen Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer &quot;Flasche Volumen / Medium Volume&quot;-Verhältnis von 5:1 kultiviert. Isolation von Roh-mitochondriale Fraktion <ol><li> Grow 1 L der Wildtypstamm BY4742 Kultur für 48 h </li><li> Gießen Kultur in 500-ml Nalgene Zentrifugenröhrchen. Balance der Last und Ernte Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Bestimmen Sie Nassgewicht Zellpellet. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in DTT-Puffer [2 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf 50-ml Falcon Rohre aus Kunststoff. </li><li> Drehen Sie das Röhrchen bei 70 rpm in einem Schüttler für 20 min bei 30 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Transfer-Zell-Suspension in einem Glaskolben. </li><li> Fügen Sie die Pulver von Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (Feuchtgewicht) Zellen], um die Zell-Suspension. </li><li> Drehen Sie den Kolben mit Zellsuspension bei 70 rpm in einem Schüttler für 30 min bei 30 ° C. </li><li> Transfer Sphäroplasten gebildet durch die Verdauung der Zellwand mit Zymolyase-100T bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen. </li><li> Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C. </li></ol> ** Alle weiteren Schritte sollten bei 4 ° C oder auf Eis durchgeführt werden. Suspensionen von Sphäroplasten sollten schonend behandelt, mit Pipetten mit geschnittenen Spitzen zu vermeiden brechen Organellen werden .** <ol start="18"><li> Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Transfer-Zellen zu einer pre-auf Eis gekühlt Glashomogenisator. </li><li> Mit einer engen Pistill Homogenisierung der Zellen, indem sie 15 Schläge von dem Pistill. </li><li> Add 1 Volumen eiskaltem Homogenisierungspuffer. </li><li> Transfer homogenisiert Sphäroplasten bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen. </li><li> Pellet ungebrochene Zellen, Kerne und große Trümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren und Pellet in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren und Pellet in 3 ml eiskaltem SEM-Puffer. </li></ol> ** Obwohl diese Suspension in den Mitochondrien angereichert ist, es enthält auch andere Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (Mikrosomen), Golgi und Vakuolen. Um reine Mitochondrien, können diese rohe mitochondriale Fraktion zur weiteren Fraktionierung unterworfen werden, wie unten beschrieben .** Reinigung von Mitochondrien ohne Verunreinigung durch andere Organellen <ol><li> Legen Sie 1,5 ml eiskaltem 60% (w / v) Saccharose in EM-Puffer in ein Beckman Ultra-Clear-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Overlay 60% (w / v) Saccharose mit 4 ml 32%, 1,5 ml von 23%, 1,5 ml 15% Saccharose (alle wt / v in EM-Puffer). </li><li> Platz 3 ml des Roh-mitochondriale Fraktion in SEM-Puffer auf 15% (w / v) Saccharose. </li><li> Zentrifuge in einem Beckman SW41 Ti Ausschwingrotor Rotor für 1 h bei 134000 xg (33000 rpm) bei 4 ° C. </li><li> Die intakten Mitochondrien bilden ein braunes Band an der 60% / 32% Saccharose-Schnittstelle. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Saccharose bis zum Erreichen der mitochondrialen Band. </li><li> Entfernen Sie die mitochondriale Band mit einer Pipette mit einem Cut-Spitze und legen Sie sie in ein Beckman Zentrifugenröhrchen für ein MLS-5 Rotor. </li><li> Füllen Sie das Rohr mit SEM-Puffer. </li><li> Pellet der reinen Mitochondrien durch Zentrifugation in einem MLS-5-Rotor für 30 min bei 10000 xg (31000 rpm) für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Überstand miteiner Pipette. </li><li> Verwenden Sie die reine Mitochondrien für die Analyse der mitochondrialen Funktionen, mitochondriale Proteom-und lipidome, und die mitochondriale DNA. </li></ol> Reagenzien <ol><li> DTT-Puffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM Dithiothreitol] (für 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 Puffer (pH 9,4) </li><li> 150 ul 1 M DTT </li><li> Volume auf 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase Puffer [20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 1,2 M Sorbitol] (für 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) </li><li> 60 ml 2 M Sorbit </li><li> Volumen auf 100 ml </li></ul></li><li> Homogenisierungspuffer [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M Sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (für 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 7,4) </li><li> 75 ml 2 M Sorbit </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g BSA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li><li> SEM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA] (für 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml 2 M Saccharose </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li><li> EM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (für 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2) </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol>
	<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry.">Biochemistry.</a> , (2004).</li><li>Suen, D. -. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics.">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li><li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+more+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li><li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+oxidants,+and+aging.">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien aus Hefezellen. Mitochondrien mit dieser Methode gereinigt sind im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung. Die beschriebene Methode liefert Mitochondrien, die sich für zellfreie Rekonstitution wesentlicher mitochondriale Prozesse sind. Diese hochreinen Mitochondrien können auch für die Analyse der mitochondrialen Struktur und Funktionen, m...

purification of mitochondria from yeast cells

Mitochondrien sind die Haupt-Website des ATP-Produktion im aeroben Stoffwechsel in eukaryotischen Zellen nicht-photosynthetischen<sup&gt; 1</sup&gt;. Diese komplexen Organellen spielen auch eine wesentliche Rolle im apoptotischen Zelltod<sup&gt; 2</sup&gt;, Das Überleben der Zelle<sup&gt; 3</sup&gt; Entwicklung von Säugetieren<sup&gt; 4</sup&gt;, Neuronale Entwicklung und Funktion<sup&gt; 4</sup&gt;, Intrazelluläre Signalwege<sup&gt; 5</sup&gt; Und Langlebigkeit Regulierung<sup&gt; 6</sup&gt;. Unser Verständnis dieser komplexen biologischen Prozesse durch Mitochondrien gesteuert setzt auf robuste Methoden zur Beurteilung ihrer Morphologie, ihrem Protein-und Lipid-Zusammensetzung, die Integrität ihrer DNA, und ihre zahlreichen lebenswichtigen Funktionen. Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Ist eine genetisch und biochemisch manipulierbar einzelligen Eukaryoten mit annotierten Genom-und Proteom-wohldefinierte, ein wertvolles Modell für die Erforschung der molekularen und zellulären Mechanismen, die die wesentlichen biologischen Funktionen der Mitochondrien. Für diese Arten von Studien, ist es entscheidend, hochreinen Mitochondrien haben. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der eine schnelle und effektive Methode zur Reinigung von Hefe-Mitochondrien. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von hochreinem Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung. Mitochondrien mit dieser Methode gereinigt werden für die zellfreie Rekonstitution wesentlicher mitochondriale Prozesse geeignet und können für die Analyse der mitochondrialen Struktur und Funktionen, mitochondriale Proteom-und lipidome und mitochondriale DNA verwendet werden.

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Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Wir beschreiben eine schnelle und effektive Methode zur Aufreinigung von Mitochondrien aus der Hefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K Aufrufe.  Concordia University. Wir beschreiben eine schnelle und effektive Methode zur Aufreinigung von Mitochondrien aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung.

Serie: Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Forschung

Biochemie

Biolistische Transformation von Hefe-Mitochondrien für die mutagenetische Analyse

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about essential, conserved mitochondrial pathways among eukaryotes, and fungi or yeast-specific pathways. One of the many abilities of S. cerevisiae is the capacity to manipulate the mitochondrial genome, which so far is only possible in S. cerevisiae and the unicellular algae Chlamydomonas reinhardtii. The biolistic transformation of yeast mitochondria allows us to introduce site-directed mutations, make gene rearrangements, and introduce reporters. These approaches are mainly used to understand the mechanisms of two highly coordinated processes in mitochondria: translation by mitoribosomes and assembly of respiratory complexes and ATP synthase. However, mitochondrial transformation can potentially be used to study other pathways. In the present work, we show how to transform yeast mitochondria by high-velocity microprojectile bombardment, select and purify the intended transformant, and introduce the desired mutation in the mitochondrial genome.

Autor im Rampenlicht: Förderung von Techniken und Entdeckungen in der Proteinsynthese und -assemblierung durch innovative mitochondriale Forschung

This work explains how to transform yeast mitochondria using a biolistic method. We also show how to select and purify the transformants and how to introduce the desired mutation in the target position within the mitochondrial genome.

Mitochondriale Transformation bei Baker

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

Genetik

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung mitochondrialer Kontaktstellen und architektonischer Einblicke 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Measuring Yeast Mitochondrial Respiration While Maintaining Cellular Context

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Mitochondriale Transformation bei Baker

Mitochondriale Transformation bei Baker

Mitochondriale Transformation bei Baker

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells