Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die zur aeroben Atmung geeignet sind. Ihre Dysfunktion ist eine bekannte Quelle menschlicher Krankheiten. Bakers Hefemitochondrien enthalten kreisförmige Genome, die acht Proteine kodieren.
In diesem Video beschrieben wir das Protokoll zur Assay-Proteinbiosynthese in Hefemitochondrien mittels radioaktiver Kennzeichnung von Translationalprodukten und anschließender Trennung durch Gelelektrophorese. Das Verfahren umfasst mehrere wichtige Schritte. Streifen Hefe aus gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit geeignetem Medium.
Legen Sie die Platten in den Kultur-Inkubator bei 30 Grad für 24 bis 48 Stunden. Impfen Sie diese Kulturen in zwei Milliliter Medium aus dem frischen Streifen in einem 15-Milliliter-Rohr und inkubieren sie über Nacht bei 200 U/min bei 30 Grad. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern.
Nehmen Sie das Volumen entsprechend 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhren Palette Hefezellen bei 9 000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie diesen Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln.
Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand. Verdünnen Sie Zellen in zwei Milliliter frisches Wischagarmedium.
Inkubationskante bei 200 Umdrehungen/ min und 30 Grad, bis die optische Dichte zwischen 1,5 und 1,9 von 1,5 bis 1,9 Werte reicht. Übertragen Sie das Kulturvolumen, das einer optischen Einheit in einem Mikrozentrifugenrohr entspricht. Drehen Sie die Rohre bei 3000 G für eine Minute.
Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln. Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur Entsorgen Sie den Überstand.
Hefezellen in 0,5 Milliliter sterilem Translationspuffer wieder aussetzen. Legen Sie die Suspension in 15 Milliliter Rohr. Fügen Sie Cycloheximid zur Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter Inkubat für fünf Minuten Rand bei 200 RPM und 30 Grad hinzu, um die zytosolische Übersetzung zu hemmen.
Fügen Sie von 25 bis 30 Hinzufügen von 25 bis 30 Mikrocurie von S35 Methionin von S35 Methionin zu Zellsuspension und inkubieren für 30 Minuten Rand bei 200 RPM und 30 Grad genommen. Fügen Sie unbeschriftetes kaltes Methionin und Borymycin hinzu, um die Etikettierung Incubate für 10 Minuten Kante bei 200 RPM und 30 Grad zu stoppen. Sammeln Sie Hefezellen durch Zentrifugation bei 9.000 G für 30 Sekunden.
Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln. Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie der Palette 75 Mikroliter Lysepuffer und Wirbel für fünf bis zehn Sekunden hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,5 Moltris Puffer von 0,5 Molarentris Puffer mit pH 6,8 hinzu. Mit pH 6.8.
Wirbel kurz. 600 Mikroliter Methanol in die Probe geben. Wirbel für fünf Sekunden.
150 Mikroliter Chloroform in die Probe geben. Wirbel für fünf Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben für zwei Minuten bei 12.000 G. Verwerfen Sie die Opaface vorsichtig mit einem Sampler.
600 Mikroliter Methanol in die Probe geben. Mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Zentrifugenproben für zwei Minuten bei 12.000 G.Discard Überstand.
Die Palette trocknet die Palette zwei Minuten bei 80 Grad. Lösen Sie gefällte Proteine in 60 Mikroliter Laemmli-Probenpuffer auf. Die Proben 10 Minuten bei 14 Grad erhitzen.
Verursachen Sie das 17.5%Laemmli SDS Polyacrylamid Gel. 15 Mikroliter jeder Probe in die Taschen geben. Führen Sie das Gel im kalten Raum, bis der blaue Farbstoff etwa 65% der Gel-Lymphe erreicht.
Färben Sie das Gel mit Kumasi brillant blau und machen Scan oder Foto, die als Ladekontrolle erforderlich ist. Trocknen Sie das Gel im Geltrockner. Bewahren Sie es drei bis fünf Tage lang in der Kassette mit Phosphor-Speicherbildschirm auf.
Scannen Sie den Bildschirm auf Phosphor-Imager. Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei Saccharomyces cerevisiae-Stämmen zugewiesen. Der wilde Typ und die mutierte Variantenlöschung des Aim23-Gens, das mitochondriale Translationinitiationsfaktor drei kodiert.
Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden bereits aktiv im denaturierenden Polyacrylamid-Gel gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle zweieinhalb Minuten vor der Sättigung gesammelt, um den Zeitverlauf aufzubauen. Das Gel wurde nach der fünftägigen Exposition gebeizt, getrocknet und gesiebt.
Bei einem erfolgreichen Experiment zeigt das Bild acht Bänder, die nach dem Standardmuster zugeordnet sind. Die Intensitäten der einzelnen Bänder können jedoch je nach Dehnung und experimentellen Bedingungen sehr variabel sein. Jede Band entspricht einem Übersetzungsprodukt.
Die Daten deuten darauf hin, dass der mutierte Stamm in der Lage ist, mitochondriale Proteinsynthese, weil alle Produkte, die in der wilden Art erscheinen, in diesem Mutanten sichtbar sind. Die Intensitäten der Bänder unterscheiden sich jedoch vom Wildtyp, was bedeutet, dass diese Deletion von Aim23 die mitochondriale Genexpression beeinflusst. Kumasi in blauem Fleck gebraut und dient als Ladekontrolle.
Ihr Ergebnis in Daten kann quantifiziert werden, um Unterschiede zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen mit Image G oder Image Quan Software zu identifizieren. Für diese wird das Verhältnis des Signals, das jedem Produkt entspricht, zum Gesamtsignal berechnet. Mittelwerte und Standardabweichungen werden in mindestens drei unabhängigen Experimenten berechnet.
Die Kinetik des umgedrehten synthetisierten Proteins wird im Experiment des vergangenen Jahres untersucht. Die Proben werden zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt, nachdem die Etikettierungsreaktion durch kaltes Methionin und Borymycin gestoppt wurde. Diese Kontrolle ist notwendig, um die Stabilität des Produkts zu schätzen.
Immunfärbung mit Anti-Porin ein Antikörper ist eine Belastungskontrolle. Wir beschrieben die Methode, die oft verwendet wird, um Proteinbiosynthese in Hefe mitochondrien zu studieren. Dieses Protokoll ist relativ einfach und schnell durchzuführen.
Gleichzeitig ermöglicht es, wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate von vier Hefe-mitochondrialen mRNAs zu erhalten, was sehr vorteilhaft ist. Es hat jedoch mehrere Einschränkungen, die zusätzliche Experimente erfordern, und liegt in diesem zwischenstaatlichen Niveau von Proteinen und mRNAs. Es kann die Informationen über diese Funktionen in mitochondrialen Übersetzungssystem zur Verfügung stellen, aber fortgeschrittenere Techniken sollten verwendet werden, um den Mechanismus zu entdecken.
