Wir erkennen an, Melissa Grunlan für hilfreiche Diskussionen über SAM-Bildung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Robert A. Welch Foundation (A-1585) unterstützt.

Vorbereitung der Reagenzien Bereiten PIPES-Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, eingestellt auf pH 6,8 mit KOH). Aliquotieren und lagern Glucose-Oxidase, Catalase und Glucose bei -70 ° C und Taxol bei -20 ° C nach den bestehenden Protokollen. 1,2 aliquotieren und lagern Tubulin bei -70 ° C gemäß den Anweisungen des Lieferanten enthalten. Pattern Au-Mikroelektroden mit Lithographie <ol><li> Cut Silizium-Wafern in 1 cm &#39;1,5 cm Substrate mittels eines Stifts oder einer Wafer-Cutter. Reinigen Sie die Substrate, indem man sie in ein Becherglas mit ausreichend Aceton um sie zu bedecken und beschallen für 5 Minuten. Ohne dass die Substrate, um zu trocknen, spülen Sie sie in frischem Aceton, dann sofort in Isopropanol und trocken mit Stickstoff zu spülen. </li><li> Fertigen Au Mikroelektroden auf der sauberen Substraten mit Standard-, Positiv-Ton Photolithographie oder Elektronenstrahl-Lithographie, abhängig von der Größe der gewünschten Funktionen. 3 Wenn der Gestaltung der Muster Geometrie, halten Sie die Durchmesser von jeder Elektrode Muster unter 100 Mikrometer, die Versorgung durch die gewährleistet PEG SAM (beschrieben im nächsten Abschnitt). Include Kontaktpads (~ 300 mm 2) positioniert 300 bis 500 mm aus dem Muster mit einem 1 mm Verbindungslinie der Pad mit der Elektrode (Abb. 1). Legen Sie die lithographische Muster in der Mitte des Substrats an Raum um das Muster für die Montage der Flusskammer ermöglichen. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Probengeometrie. Bitte <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. </li><li> Nach der Entwicklung des Musters in der Lackschicht, kratz eine Zeile in der von der Kontaktstelle an den Rand des Substrates mit einer Pinzette (Abb. 1) zu widerstehen. Nach Metallabscheidung wird die Grund erlauben den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode und dem Rand des Substrates. Ein Abscheidekammer, vorzugsweise mit zwei Quellen, wird die Metallschicht zu hinterlegen. Die Elektroden sind durch Ablagerung von 2 nm von Cr (für die Adhäsion) von 6 nm Au gefolgt, ohne zu brechen Vakuum gebildet. Ein Quarzmikrowaage im Inneren der Kammer ausgestattet sind, können verwendet werden, um die Dicke der Folien während der Abscheidung zu messen. </li></ol> Bereiten Sie die SAM <ol><li> Vorheizen und Backofen in einem gut belüfteten Raum auf 75 ° C Bereiten Sie die Silanisierung Lösung durch Zugabe von 20 ml Toluol in einen 250 mL Becherglas. Dann fügen Sie 1 mL PEG-Silan (dh 5% v / v), um das Toluol mit einem Kunststoff-Pipette. Mix in der PEG-Silan gut durch Auf-und Abpipettieren von 5 bis 10 mal und dann unter Rühren mit der Pipette für 30 Sekunden. </li><li> Legen Sie die gemusterten Proben in das Becherglas mit der strukturierten Seite nach oben, um sicherzustellen, dass sie vollständig in der PEG-Silan-Toluol-Lösung getaucht und gleichmäßig über den Boden des Bechers angeordnet. Das Becherglas in den Ofen und backen 18 bis 21 Stunden bei 75 ° C. Während die SAM bildet, bereiten die Gegenelektrode (siehe unten) und montieren alle weiteren Komponenten für die verbleibenden Schritte erforderlich. </li><li> Nach 18-21 Stunden im Ofen, sollte das Toluol verdampfen Verlassen des gemusterten Proben in einer viskosen PEG-Silan-Rückstand. Fügen Sie 20 ml Toluol in das Becherglas und genießen die Proben für 1-2 Minuten. Entfernen Sie die Proben aus dem Becher und gründlich mit Toluol, dann Isopropanol und schließlich mit Stickstoff trocken. An diesem Punkt sollten die Proben sauber aussehen und die SAM-Schicht sollte unsichtbar für das bloße Auge. SAMs vorbereitet auf diese Weise sind nutzbar für bis zu zwei Tagen, wenn sie unter kühlen und trockenen Bedingungen (25 ° C, mäßiger Luftfeuchtigkeit) gelagert. Erfolglose SAM-Bildung entsteht eine trübe oder unebenen hued Rückstände auf der Oberfläche. </li></ol> Herstellung der Gegenelektrode In der gleichen Abscheidekammer Setup für Mikroelektroden Abscheidung verwendet, um eine Gegenelektrode durch die Hinterlegung von 1 nm Cr, um 4 nm Au auf einer 22 x 50 mm Nr. 1 oder Nr. 0 Deckglas gefolgt. Die Gegenelektrode sollte fast transparent mit einem hellgrauen oder rosa Färbung. Bewahren Sie die Gegenelektrode beschichtet-side-up in einer Petrischale, um es sauber zu halten. Polymerisieren Tubulin in MTs <ol><li> Thaw unmarkiertem Tubulin und Rhodamin Tubulin und sofort bei einem Verhältnis von 1:2 markiert, um unmarkierte zu hell MTs erhalten kombinieren. Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Polymerisieren die Tubulin für 20-40 Minuten in einem beheizten Wasserbad bei 37 ° C. Die Länge des MTs größer sein wird für längere Polymerisationszeiten. Während die Tubulin-Polymerisation ist, bereiten Sie einen PIPES-Taxol-Puffer durch Zugabe von Taxol zu 20 mM in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit PIPES-Puffer. Mix der Taxol auch durch Auf-und Abpipettieren mehrmals und Vortexen, und dann den Schlauch in das beheizte Bad bei 37 ° C. Nach der Polymerisation verdünnen MTs von 1 / 100 in warmen Rohren-Taxol-Puffer und Schildvon Licht. MTs auf diese Weise vorbereitet wird länglich im Laufe der Zeit und zu bündeln, die durch weitere Verdünnung reduziert werden kann. </li><li> Bereiten Sie eine 10-Sauerstoffbindung Mischung (OS) durch die Kombination von 30 ml kaltem PIPES-Puffer (0-4 ° C), 5 ml 50% 2-Mercaptoethanol, 5 mL Glucose-Oxidase, 5 mL Katalase und 5 mL Glukose. 2 Die Glucose sollte letzte sein. Mix von Auf-und Abpipettieren 3-5 mal nach dem Hinzufügen jeder Komponente. Legen Sie die OS-Gemisch auf Eis, es bleibt für etwa 2 Stunden wirksam. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die MT Polymerisation erfolgreich war und dass die MTs sind unter mehreren Minuten Fluoreszenzanregung durch bildgebende die vorbereitete MTs mit 1x OS Mischung stabil. Für die Bildgebung der MTs auf diese Weise hergestellt werden, dass eine Anregung / Emission-Filter-Kombination eignet sich für Rhodaminfluoreszenz verwenden. Bestimmen Sie die besten Arbeitsbedingungen Verdünnung für die Bildgebung einzelnen Filamente durch weitere Verdünnung der MTs von 1 / 10 bis 1 / 100 mit Rohren Puffer und Bildgebung mit 1x OS mischen. </li><li> Bereiten Sie eine Flusskammer durch Einfügen einer großen (22 x 50 mm) und kleine (22 x 22 mm) Deckglas mit zwei Stücken doppelseitigem Klebeband angebracht 2-3 mm auseinander. Das Band wird einfach in Streifen, indem sie auf einen Objektträger und Schneiden mit einer Rasierklinge geschnitten. Führen Sie ein paar Mikroliter MTs in die Messzelle mit einer Mikropipette. Für hohe Vergrößerung Bildgebung kann lange Objektive für die Abbildung der oberen Fläche der Flusskammer erforderlich sein. Der Abstand vom Deckglas / Probenoberfläche auf die Oberseite der Flusskammer wird durch die Dicke des Bandes bestimmt und sollte 60-100 mm sein. </li></ol> Pattern MTs mittels Elektrophorese <ol><li> Bereiten Sie eine Elektrophoresekammer, indem man zwei dünne Streifen doppelseitiges Klebeband über die strukturierte, SAM-beschichteten Probe, so dass die Elektrode zwischen den Streifen mit dem Verbindungsweg senkrecht auf das Band (Abb. 2). Legen Sie die Gegenelektrode auf dem doppelseitigen Klebeband mit der metallenen Seite berühren Sie das Band, so dass die Kante der Probe Überhänge der Gegenelektrode um etwa 3 mm (Abb. 2). Cut mehrere 15 cm Länge der isolierten Kupfer-Lackdraht und Streifen 1 cm der Isolierung off der beiden Enden. Befestigen Sie einen Draht zu den exponierten Au Fläche des Substrats mit einem kleinen Tropfen Silber-Lackierung und gleichzeitig dafür Sorge zu vermeiden, einen elektrischen Kontakt mit der Gegenelektrode (dies kann mit einem Multimeter überprüft werden). Schließen Sie einen zweiten Draht zur Gegenelektrode mit Silberfarbe. Drähte mit Silberfarbe befestigt werden weiter zu den Proben mit Klebeband befestigt werden. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Durchfluss-Modul für eine invertierte Fluoreszenzmikroskop. Bitte <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. </li><li> Einführung MTs in der gewünschten Verdünnung mit Pipes-Puffer mit OS auf 1x Endkonzentration kombiniert. Bild in 20-facher Vergrößerung und suchen Sie das Muster auf den Silizium-Wafer vor dem Anlegen einer Spannung. Optional kann der Strömungsraum abgedichtet mit Nagellack Strömungs-und MT Migration in der Ebene der Flusskammer zu verhindern. </li><li> Tragen Sie eine Spannung von bis zu 1 V und beobachten die Migration von MTs. Niedrigere Spannungen (bis etwa 0,5 V) verwendet werden, wenn reversible Überfüllung von MTs erwünscht ist, aber dies erfordert Abdichtung der Flusskammer zur seitlichen Drift zu verhindern. Nagellack funktioniert gut für die Abdichtung der offenen Enden der Flusskammer. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0.7 V, können einige MT Haftung auf das Muster gesehen werden, obwohl es wird schwach sein. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0,9 V, wird das MT-Migrations schneller sein, und die Haftung stärker sein wird. Oberhalb von etwa 1,2 V die Wahrscheinlichkeit für die Induktion Elektrolyse (Gasblasenbildung) und auch für die Zerstörung der Mikroelektroden deutlich erhöht. Migration kann durch Einstellen der vertikalen Ebene der Fokus des Mikroskops verfolgt werden. Wenn richtig ausgeführt, wird die MTs an die Oberfläche der Elektroden lokalisiert werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Rai-Choudhury, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. , (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Migration von MTS ist einfach visualisiert mittels Fluoreszenz-Mikroskopie aufgrund ihrer Helligkeit und der geringe Hintergrundfluoreszenz. Die Methode ist allgemein anwendbar auf Biomolekül Strukturierung, wie es verlangt nur, dass die Biomoleküle bewogen, eine Nettoladung durch eine geeignete Einstellung des pH tragen. Elektroosmose ist in dieser Konfiguration zu vermeiden, weil es keine geladenen Oberflächen wie z. B. die Kieselsäure Wände in der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden. <p class="jove_...

Nr. 1 Borosilikatglas Deckgläser (22 X 50 mm) wurden von VWR erworben. Polierte electronic grade p-Typ &lt;111&gt; Silizium-Wafer wurden von Addison Engineering, Inc. erworben Hochreine Silberfarbe von Structure Probe, Inc. (Katalog # 5001 AB) erhalten. Isolierte Feinstrick Kupfer Lackdraht (~ 0,08 mm (0,003) Durchmesser) können von der elektronischen Zulieferunternehmen bezogen werden.

antifouling self-assembled monolayers on microelectrodes for patterning biomolecules

Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (ethylenglycol) (PEG) trimethoxysilan selbstorganisierten Monoschicht (SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einer einzigen Versammlung Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die SAM ist die Beschichtung Mikroelektroden mit Standard-, Positiv-Ton-Lithographie strukturiert werden. Mit der Mikrotubuli als Beispiel verwenden wir eine Gleichspannung an elektrophoretische Migration auf die SAM-beschichteten Elektrode in einer reversiblen Weise zu induzieren. Eine Flusskammer ist für die Bildgebung der elektrophoretischen Migration und Mikrotubuli-Strukturierung eingesetzt<em&gt; In situ</em&gt; Mit Epifluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ist allgemein anwendbar auf Biomolekül Strukturierung, wie es Elektrophorese verwendet, um Zielmoleküle immobilisieren und erfordert daher keine spezifische molekulare Wechselwirkungen. Darüber hinaus vermeidet es Probleme beim Versuch, Muster der SAM-Moleküle direkt mit lithographischen Techniken. Die Kompatibilität mit Elektronenstrahl-Lithographie ermöglicht diese Methode, um Muster von Biomolekülen im Nanometerbereich eingesetzt werden.

Watch this Scientific Journal Video about Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules at JoVE.com

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.

Antifouling Selbstorganisierte Monoschichten auf Mikroelektroden für die Strukturierung von Biomolekülen

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Aufrufe.  Texas A&M University (TAMU). Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.

Serie: Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Patterning Cells on Optically Transparent Indium Tin Oxide Electrodes

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular constructs serving as in vitro mimics of native tissues.  In this study, photolithography and wet etching techniques were used to fabricate individually addressable indium tin oxide (ITO) electrodes on glass substrates.  The glass substrates containing ITO microelectrodes were modified with poly(ethylene glycol) (PEG) silane to make them protein and cell resistive.  Presence of insulating PEG molecules on the electrode surface was verified by cyclic voltammetry employing potassium ferricyanide as a redox reporter molecule.  Importantly, the application of reductive potential caused desorption of the PEG layer, resulting in regeneration of the conductive electrode surface and appearance of typical ferricyanide redox peaks.    Application of reductive potential also corresponded to switching of ITO electrode properties from cell non-adhesive to cell-adhesive. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.  Micropatterning of several cell types was demonstrated on these substrates.   In the future, the control of the biointerfacial properties afforded by this method will allow to engineer cellular microenvironments through the assembly of three or more cell types into a precise geometric configuration on an optically transparent substrate.

Non-fouling PEG silane monolayer was desorbed from individually addressable ITO electrodes on glass by application of a reductive potential. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.

Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular ...

Biologie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Ingenieurwesen

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Neurowissenschaften

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics paradigm, especially in biomedical research. Recreating artificial life-like actuation dynamics is crucial for a soft-robotic system. However, the precise control and tuning of actuation behavior still represents one of the main challenges of modern soft robotic systems. This method describes a low-cost, highly scalable, and easy-to-use procedure to fabricate an electrically controllable soft robot with life-like movements that is activated and controlled by the contraction of cardiac muscle tissue on a micropatterned sting ray-like hydrogel scaffold. The use of soft photolithography methods makes it possible to successfully integrate multiple components in the soft robotic system, including micropatterned hydrogel-based scaffolds with carbon nanotubes (CNTs) embedded gelatin methacryloyl (CNT-GelMA), poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), flexible gold (Au) microelectrodes, and cardiac muscle tissue. In particular, the hydrogels alignment and micropattern are designed to mimic the muscle and cartilage structure of the sting ray. The electrically conductive CNT-GelMA hydrogel acts as a cell scaffold that improves the maturation and contraction behavior of cardiomyocytes, while the mechanically robust PEGDA hydrogel provides structural cartilage-like support to the whole soft robot. To overcome the hard and brittle nature of metal-based microelectrodes, we designed a serpentine pattern that has high flexibility and can avoid hampering the beating dynamics of cardiomyocytes. The incorporated flexible Au microelectrodes provide electrical stimulation across the soft robot, making it easier to control the contraction behavior of cardiac tissue.

A bioinspired scaffold is fabricated by a soft photolithography technique using mechanically robust and electrically conductive hydrogels. The micropatterned hydrogels provide directional cardiomyocyte cell alignment, resulting in a tailored direction of actuation. Flexible microelectrodes are also integrated into the scaffold to bring electrical controllability for a self-actuating cardiac tissue.

Bioinspirierter Softroboter mit integrierten Mikroelektroden

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...