Vorbereitung von gewaschenen menschlichen Blutplättchen für quantitative Stoffwechselflussstudien

Der Thrombozytenstoffwechsel ist von Interesse, insbesondere da er sich auf die Rolle der Hyper- und Hypoaktivität von Blutplättchen bei Blutungen und thrombotischen Erkrankungen bezieht. Die Isolierung von Blutplättchen aus dem Plasma ist für einige metabolische Assays notwendig. Hier wird ein Verfahren zur Isolierung intrazellulärer Metaboliten aus gewaschenen Blutplättchen vorgestellt.

Blutplättchen sind Blutzellen, die eine wesentliche Rolle bei der Blutstillung und der angeborenen Immunantwort spielen. Hyper- und Hypoaktivität von Blutplättchen wurde mit Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht, was das Risiko für Thrombosen und Blutungen erhöht. Die Aktivierung der Blutplättchen und der Stoffwechsel sind eng miteinander verknüpft, wobei es zahlreiche Methoden zur Messung der ersteren gibt, aber relativ wenige für die letzteren. Um den Thrombozytenstoffwechsel ohne die Interferenz anderer Blutzellen und Plasmabestandteile zu untersuchen, müssen Blutplättchen isoliert werden, ein Prozess, der aufgrund der Scherempfindlichkeit der Blutplättchen und der Fähigkeit, irreversibel zu aktivieren, nicht trivial ist. Hier wird ein Protokoll für die Thrombozytenisolierung (Waschen) vorgestellt, das ruhende Thrombozyten erzeugt, die empfindlich auf Stimulation durch Thrombozytenagonisten reagieren. In aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten werden Thrombozyten unter Zugabe von Thrombozyteninhibitoren aus dem Vollblut isoliert und in einem kontrollierten, isosmotischen Puffer resuspendiert. Diese Methode führt reproduzierbar zu einer 30%-40%igen Rückgewinnung von Blutplättchen aus Vollblut mit geringer Aktivierung, gemessen anhand von Markern der Granulatsekretion und der Integrinaktivität. Die Thrombozytenzahl und die Kraftstoffkonzentration können präzise gesteuert werden, so dass der Benutzer eine Vielzahl von Stoffwechselsituationen untersuchen kann.

Blutplättchen sind kleine Zellen (2–4 μm Durchmesser), die eine wichtige Rolle bei der Blutstillung spielen, dem streng regulierten Prozess der Gerinnselbildung¹. Blutplättchen sind zwar für die Gefäßintegrität von entscheidender Bedeutung, aber auch an unerwünschten gesundheitlichen Ereignissen beteiligt. Blutplättchen sind an tiefen Venenthrombosen (TVT) und arteriellen Thrombosen (AT) beteiligt, bei denen es sich um Blutgerinnsel handelt, die Blutgefäße verschließen und lokal zu einer verminderten Blutversorgung führen, oder, wenn Teile des Gerinnsels abbrechen (embolisieren), die Blutversorgung der Lunge, des Herzens oder des Gehirns blockieren^können 2,3,4,5,6,7 . Thrombozytenhyperreaktivität ist eine Komorbidität von Bluthochdruck, Diabetes und Krebs, die zu einer erhöhten Inzidenz von TVT und AT ^8,9,10 führt. Die Thrombozytenaktivierung und der Metabolismus sind eng miteinander verknüpft^11,12, was zu einem erhöhten Interesse an der Ausrichtung des Thrombozytenstoffwechsels als therapeutische Strategie führt^13,14. Es gibt eine Debatte über die genaue metabolische Neuverdrahtung, die bei der Aktivierung stattfindet, und dies ist ein aktives Forschungsfeld¹⁵. Dieses gestiegene Interesse an der Thrombozytendysfunktion bei Krankheiten und ihren Verbindungen zum Stoffwechsel unterstreicht die Notwendigkeit einer wiederholbaren Methode zur Isolierung von Blutplättchen und zur Untersuchung ihres Stoffwechsels.

Menschliche Blutplättchen werden in der Regel durch Venenpunktion gewonnen und dann aus Vollblut isoliert.  Gewaschene Blutplättchen werden durch aufeinanderfolgende Wasch- und Zentrifugationsschritte¹⁶ vom Vollblut getrennt. Dies wurde ursprünglich von Mustards Gruppe¹⁷ gemacht und von Cazenaves Gruppe¹⁸ leicht modifiziert. Eine weitere Alternative sind gelfiltrierte Blutplättchen, die aus plättchenreichem Plasma (PRP) durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer gepackten Säule von Agarose-Gelkügelchen^{gewonnen werden können 19}. Es gibt viele Waschprotokolle sowohl für menschliches als auch für Nagetierblut, die für verschiedene Assays optimiert sind 20,21,22,23, jedoch nicht für die Messung des Thrombozytenstoffwechsels.

Zu den Techniken zur Untersuchung des Thrombozytenstoffwechsels gehören bioenergetische Messungen mit dem Seahorse XF-Analysator 11,24,25,26,27, extrazelluläre Flussmessungen 11,13,24, Metabolomik ^14,28 und isotopengestützte Stoffwechselflussanalyse (¹³C-MFA)29. In metabolomischen Studien besteht das Ziel typischerweise darin, veränderte Signalwege zwischen zwei verschiedenen Zuständen zu bestimmen (z. B. Ruhezustand vs. aktivierte Blutplättchen¹⁴). Metabolomische Studien beinhalten den Einsatz von Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Diese Studien können für intra- oder extrazelluläre Metaboliten durchgeführt werden und sind häufig mit einer Signalweganalyse oder einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) ^{gekoppelt14,28}. Bei der isotopengestützten Stoffwechselflussanalyse (¹³C-MFA) werden Zellen mit einem markierten Substrat, einem sogenannten Tracer, füttert und gemessen, wie sich dieser Tracer durch ein Reaktionsnetzwerk mit LC-MS ausbreitet. Diese Technik ermöglicht die Berechnung von Flüssen durch Stoffwechselwege mit einer Auflösung auf Reaktionsebene ^29,30. In Vollblut und plättchenreichem Plasma (PRP) unterliegt die Kraftstoffkonzentration (Glukose, Glutamin, Acetat usw.) einer Variabilität von Spender zu Spender, und das im Plasma vorhandene Albumin und Sexualhormon-bindendes Globulin kann die aktive Konzentration von Hormonen, Arzneimitteln und anderen biologisch relevanten Molekülen verändern³¹. Gewaschene Blutplättchen bieten ein Verfahren zur Suspendierung von Blutplättchen in einem benutzerdefinierten Medium, einschließlich bekannter Brennstoffkonzentrationen, das mit ¹³C-MFA³² kompatibel ist.

Hier wird ein Verfahren zur Thrombozytenwäsche beschrieben, um Blutplättchen herzustellen, die in Stoffwechselassays verwendet werden können. Das Protokoll produziert ruhende Blutplättchen mit geringer Kontamination der roten und weißen Blutkörperchen.  Der Status der Thrombozytenaktivierung wurde mittels Durchflusszytometrie von Thrombozytenaktivierungsmarkern überwacht. Dieses Protokoll erreicht reproduzierbar eine Thrombozytenwiederherstellung von mindestens 30 % bis 40 % im Verhältnis zur Thrombozytenzahl im Vollblut. Die mit dieser Technik erhaltenen gewaschenen Blutplättchen eignen sich für die Stoffwechselanalysetechniken, und die Methode zur Extraktion intrazellulärer Metaboliten kann auf die Analyse nach Wahl des Benutzers zugeschnitten werden (LC-MS, GC-MS, photometrischer Assay usw.).

Die Studie wurde vom Institutional Review Board vom Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt. Von allen Studienteilnehmern wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Die Teilnehmer gaben an, in den letzten 48 Stunden keinen Alkohol oder in den letzten zehn Tagen nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) konsumiert zu haben. Dieses Projekt wird vom National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer R61HL141794 unterstützt.

1. Blutentnahme

1. Für die Blutabnahme einrichten. Es wird empfohlen, die Blutentnahme von einem ausgebildeten Phlebotomisten durchführen zu lassen.
2. Führen Sie eine Venenpunktion am Innenarm mit einer 19 G Nadel durch.
3. Sammeln Sie die ersten ~2 mL in einem zusatzstofffreien Vacutainer und entsorgen Sie sie. Dies dient dazu, chemische Signalmoleküle aus geschädigten Endothelzellen zu entfernen, die Blutplättchen aktivieren können. Nachdem die ersten 2 ml entnommen wurden, entfernen Sie das Tourniquet, um die Scherbelastung der Blutplättchen zu reduzieren.
4. Sammeln Sie den Rest des Blutes in Antiokoagulenten-Citrat-Dextrose-Vakutainern (ACD-A) im Verhältnis 14:3 (Blut:ACD-A). Drehen Sie jeden Vacutainer nach der Blutentnahme vorsichtig um, um Blut und Antikoagulans zu mischen.

2. Waschen von Blutplättchen

Abbildung 1: Aufeinanderfolgende Zentrifugations- und Resuspensionsschritte bei der Thrombozytenwaschung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Verwenden Sie Transferpipetten, um Blasen zu entfernen, wenn sie gebildet werden, insbesondere vor dem Zentrifugieren. Jedes Mal, wenn die Röhrchen mit Blut/Blutplättchen geöffnet/geschlossen werden, wird empfohlen, vor dem Schließen der Kappe in das Röhrchen zu atmen, um den CO_{2 -} Gehalt zu erhöhen.

1. Zentrifuge auf 37 °C vorheizen, um Temperatureffekte zu reduzieren. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten des Protokolls ist die Zentrifuge auf 37 °C zu halten.
2. Das Wasserbad auf 37 °C vorheizen. Geben Sie den modifizierten Tyrode-Puffer mit Glukose in das Wasserbad.
   HINWEIS: Das geänderte Pufferrezept von Tyrode finden Sie in der Zusatzdatei 1.
3. Kombinieren Sie das gesammelte Vollblut aus allen Vacutainern in konische 50-ml-Polypropylen-Röhrchen. Entnehmen Sie mit einer abgeschrägten Pipettenspitze, die in einem Winkel von 45° geschnitten ist, ein geeignetes Probenvolumen, um eine Zellzählung durchzuführen (siehe Zellzählung).
4. Entfernen Sie alle Blasen, die durch vorsichtiges Absaugen mit einer Transferpipette mit schmaler Bohrung entstehen.
5. Lassen Sie das Blut 25 Minuten lang bei 37 °C im Wasserbad ruhen. Dadurch können Blutplättchen in einem reversibel aktivierten Zustand (von der Entnahme aus dem Körper, der Übertragung von Tube zu Tube usw.) in einen Ruhezustand zurückkehren.
6. Um eine Aktivierung während der Zentrifugation zu verhindern, geben Sie 500 nM Prostaglandin I₂ (PGI2) und 0,02 U/ml Apyrase in das Vollblut und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie es einmal invertieren.  Entfernen Sie alle Blasen, die mit einer Transferpipette mit schmaler Bohrung entstanden sind.
   HINWEIS: Eine Anleitung für das richtige Rezept für_{g.g.g.A. 2} und Apyrase finden Sie in der Zusatzdatei 1.
7. Zentrifugieren Sie Vollblut, um plättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten (15 Minuten bei 250 x g für 42 ml Vollblut) ohne Bremse (37 °C).
8. Sammeln Sie das PRP (obere gelbe Schicht über dem Buffy Coat und der roten Blutschicht) vorsichtig mit einer Transferpipette mit breiter Bohrung in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
9. Kippen Sie beim Übertragen ein sauberes konisches Rohr und führen Sie das PRP vorsichtig an der Seite des Rohrs entlang. Vermeiden Sie Luftblasen.
10. Lassen Sie ca. 3 mm PRP zurück, um das Buffy Coat (die Schicht der weißen Blutkörperchen zwischen dem PRP und dem roten Blut) nicht zu stören. Wenn dies gestört wird, sieht es aus wie ein plötzlicher weißer Wirbel in der Transferpipette.
11. Nehmen Sie die Zellzahl (siehe Zählen von Blutplättchen), um das Resuspensionsvolumen für den nächsten Waschschritt zu bestimmen.
12. 10 Minuten bei 37 °C ruhen lassen.
13. Entnehmen Sie mit einer abgeschrägten Pipettenspitze eine Probe für die Durchflusszytometrie (siehe Durchflusszytometrie).
14. Geben Sie 500 nM PGI₂ und 0,02 U/ml-Apyrase zu PRP und mischen Sie durch vorsichtiges Umdrehen.
15. 10 Minuten bei 1000 x g bei 37 °C zentrifugieren (Beschleunigung:0 Bremse: 0). Bremse nicht verwenden. Das Pellet ist nicht kompakt und ein plötzliches Bremsen kann zu einer erneuten Vermischung führen.
16. Während des Zentrifugierens das Resuspensionsvolumen bestimmen. Gehen Sie von einer Rückgewinnung von 75 % aus. Stellen Sie die Zelldichte auf ca. 3x10⁵ Zellen/μl her.
17. Der Überstand wird mit einer Kunststoffpipette mit breiter Bohrung für das Schüttvolumen und einer 1-ml-Pipette (ungeschnittene Spitze) für den Rest der Flüssigkeit in der Nähe des Pellets aspiriert. Vermeiden Sie es, die Pellets am Boden des Rohrs zu berühren.
18. Geben Sie 500 nM PGI₂ und 0,02 U/ml Apyrase zu modifiziertem Tyrode-Puffer. Fügen Sie langsam die berechnete Menge des Puffers aus Schritt 16 hinzu, indem Sie an der Seite des konischen Rohrs herunterrieseln.
19. Verwenden Sie eine abgeschrägte Spitze und eine 1-ml-Pipettenspitze, indem Sie das Pellet vorsichtig mehrmals auf und ab pipettieren.
    1. Stellen Sie das Volumen auf 300 μl ein, drücken Sie den Kolben ganz durch, während Sie sich über der Flüssigkeitslinie befinden, platzieren Sie die Pipette unter der Flüssigkeit und kommen Sie bis zum ersten Anschlag. Auf diese Weise kann der Wissenschaftler das Pellet resuspendieren, ohne versehentlich Luftblasen zu erzeugen, die die Blutplättchen aktivieren können.
    2. Gelegentlich befindet sich am Boden des Pellets ein Ring aus sichtbaren roten Blutkörperchen. Vermeiden Sie es, dies erneut zu unterbrechen.
20. Sobald das Pellet resuspendiert ist, verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung, um das resuspendierte Pellet in ein neues konisches Röhrchen zu übertragen, wobei alle roten Blutkörperchen oder sichtbar verklumpten Zellen zurückbleiben.
21. Wiederholen Sie die Schritte 11-20. Stellen Sie sicher, dass Sie 500 nM PGI₂ und 0,02 U/ml aus einem frischen Aliquot in den modifizierten Tyrode-Puffer geben (verwenden Sie den modifizierten Tyrode-Puffer aus Schritt 18 nicht wieder, PGI₂ ist zu instabil).
22. Entnehmen Sie eine Probe für eine Zellzählung. Passen Sie die Thrombozytenkonzentration nach Bedarf mit modifiziertem Tyrode-Puffer an.
23. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit abgeschrägtem Schnitt, um eine Probe für die Durchflusszytometrie zu entnehmen.
24. Lassen Sie die Blutplättchen 1 h bei 37 °C ruhen, damit die Inhibitoren nachlassen können und alle reversibel aktivierten Blutplättchen in einen Ruhezustand zurückkehren können.
25. Vorsichtig mit einer Pipette mit breitem Durchgang mischen. Entnahme von Proben für die Durchflusszytometrie.
26. Die gewaschenen, ruhenden Blutplättchen sind nun bereit, für die Stoffwechselanalyse verwendet zu werden.

3. Zählen von Blutplättchen

1. Blutplättchen können entweder mit einem automatisierten Blutkörperchenzähler (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers) oder einem Hämozytometer³³ gezählt werden.

4. Durchflusszytometrie

1. Präparat
   1. Detaillierte Protokolle und Übersichten über Best Practices für die Einrichtung von Antikörpermischungen und die Vorbereitung des Durchflusszytometers zur Messung der Thrombozytenaktivierung finden Sie an anderer Stelle^34,35.
2. Probenahme
   1. Wenn Sie eine Probe für die Durchflusszytometrie entnehmen, entnehmen Sie die Thrombozytensuspension mit einer abgeschrägten Pipettenspitze. Geben Sie dies langsam in das Mikrozentrifugenröhrchen mit den Antikörpern und schnippen Sie dann vorsichtig zum Mischen. 30 s inkubieren lassen.
   2. Übertragen Sie die Thrombozytensuspension/Antikörpermischung mit einer abgeschrägten Pipettenspitze in die entsprechende Vertiefung auf der 96-Well-Platte.
   3. Geben Sie sofort Fixiermittel in die Vertiefung, um die Zellen zu fixieren.
   4. Innerhalb von 8 Stunden nach der Fixierung auf dem Durchflusszytometer laufen lassen.
3. Empfindlichkeitstests für Agonisten
   1. Stellen Sie nach dem Waschen 2 konische Röhrchen zu 15 ml beiseite, eines für eine Ruhekontrolle und eines für eine Thrombin-aktivierte Kontrolle.
   2. Pipettieren Sie vorsichtig 100 μl Thrombozytensuspension mit einer abgeschrägten Pipettenspitze in jedes konische Röhrchen. Bei 37 °C 1 h ruhen lassen.
   3. Nach der einstündigen Pause geben Sie 0,1 U/ml Thrombin in ein Röhrchen (Anweisungen zur Thrombinvorbereitung finden Sie in der Zusatzdatei 1) und das Vehikel in das andere. Bei 37 °C 15 min inkubieren.
   4. Entnehmen Sie von jedem Röhrchen eine Durchflusszytometrie-Probe, um die Thrombozytenempfindlichkeit gegenüber Agonisten zu bestimmen.

5. Probenahme für die quantitative Stoffwechselflussanalyse

1. Abschrecken
   HINWEIS: Das Löschen des Stoffwechsels ist ein notwendiger Schritt zur Messung genauer Stoffwechselflüsse. Das schnelle Abkühlen der Zellen und das Halten ihrer Temperatur auf oder unter 4 °C verlangsamt den Stoffwechsel so sehr, dass davon ausgegangen werden kann, dass er im Wesentlichen gestoppt ist, so dass die beprobten Zellen den Stoffwechsel der Zellen aus der Masse genau widerspiegeln. Es gibt eine Vielzahl von Methoden, die verwendet werden können, aber um die Notwendigkeit einer schnellen Abkühlung und die Minimierung von Leckagen auszugleichen, verwenden Sie kalte (-4 °C) normale Kochsalzlösung³⁶. Wenn Salz die anschließende Analyse beeinträchtigt, kann eine andere Flüssigkeit verwendet werden (Methanol/Wasser, Ethanol usw.)³⁷. Urheberrecht
   1. Aliquots von normaler Kochsalzlösung vorbereiten und einfrieren. Machen Sie jede Kochsalzlösung aliquot im 6-fachen Volumen der gewünschten Probe.
      HINWEIS: Das normale Kochsalzrezept finden Sie in der Zusatzdatei 1.
   2. Mikrozentrifuge auf 0 °C vorkühlen.
   3. Sammeln Sie Thrombozytensuspension in teilweise gefrorener normaler Kochsalzlösung (< -4 °C) im Verhältnis 1:6 (z. B. sammeln Sie 150 μl Thrombozytensuspension in 750 μl Kochsalzlösung in Mikrozentrifugenröhrchen).
      HINWEIS:Lassen Sie die Thrombozyten-/Kochsalzlösung nicht länger als 15 Minuten auf Eis.
   4. Zentrifugieren bei 16.000 x g, 0 °C für 10 min.
   5. Bewahren Sie den Überstand für die externe Metabolitenanalyse und das Pellet für die Extraktion und Messung intrazellulärer Metaboliten auf. Beide werden bis zur Analyse bei -20 °C gelagert.
   6. Wiederholen Sie diesen Vorgang über das gewünschte Zeitintervall und die gewünschte Anzahl von Abtastzeitpunkten.
2. Intrazelluläre Metaboliten-Extraktion
   1. Geben Sie 0,5 mL vorgekühltes 7:3 Methanol-Wasser bei -20 °C in das abgeschreckte Pellet. 1 Minute lang kräftig vortexen.
   2. In flüssigem Stickstoff einfrieren, bei 0 °C auftauen und dann für 2 weitere Zyklen wiederholen.
   3. Die Suspensionen werden bei 16.000 x g 10 Minuten lang bei -4 °C zentrifugiert.
   4. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.
   5. Verwenden Sie das Pellet aus Schritt 3 und wiederholen Sie das Extraktionsprotokoll (Schritte 1-3) mit 50:50 Methanol:Wasser. Fügen Sie den zweiten gesammelten Extrakt zum ersten hinzu. Über Nacht trocknen.
   6. Resuspendieren Sie den getrockneten Extrakt in 150 μl Wasser der LC-MS-Qualität (oder einem anderen für die beabsichtigte Analyse geeigneten Lösungsmittel). 15 Minuten bei 4 °C mixen. Kurz vortexen und in 0,22 μm Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen, um Zelltrümmer zu entfernen. 5 Minuten bei 16.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
   7. Aus der Zentrifuge nehmen, weitere 50 μl Optima-Wasser auf den Filter pipettieren und erneut zentrifugieren (5 min, 16.000 x g und 4 °C), um den Filter zu spülen. Sammeln Sie für die Analyse.

Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 2 repräsentieren 6 verschiedene Blutspender, darunter 3 Männer und 3 Frauen. Die Thrombozytenausbeute im Verhältnis zum Vollblut ist in Abbildung 2A dargestellt. Die endgültige Thrombozytenerholung betrug durchschnittlich 52 % ± 3 % (Standardabweichung, n=6). Die endgültige Thrombozytenzahl im Vergleich zur Kontamination der weißen Blutkörperchen wurde mit einem automatisierte...

Blutplättchen reagieren sehr empfindlich auf ihre Umgebung, einschließlich Scherspannung und Vorhandensein von Agonisten ^38,39. Dies macht die Handhabung und Isolierung von Blutplättchen schwierig, so dass die Verwendung von Inhibitoren und Pipetten mit breitem Durchgang von entscheidender Bedeutung^{ist 40}. Die richtige Lagerung und Zubereitung von PGI₂ ist von entscheidender Bedeutung, da die...

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu berichten.

Die Autoren danken Dr. Emily Janus-Bell und Clarisse Mouriaux aus dem Labor von Dr. Pierre Mangin und Katrina Bark aus dem Labor von Dr. Jorge DiPaola für ihre Anleitung und ihren Rat.