Die Erstellung eines Rattenmodells für Osteosarkopenie mittels Ovariektomie

Dieses aktuelle Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erstellung eines Rattenmodells für Osteosarkopenie mittels Ovariektomie.

Die Osteosarkopenie (OS), eine komplexe degenerative Erkrankung, ist durch den gleichzeitigen Rückgang der Skelettmuskelmasse und der Knochenmineraldichte (BMD) gekennzeichnet und stellt eine enorme Gesundheitsgefahr für die ältere Bevölkerung dar. Trotz seiner klinischen Relevanz sind die pathophysiologischen Mechanismen, die dem OS zugrunde liegen, nicht vollständig verstanden, was die Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses seiner Ätiologie unterstreicht, um effektive Behandlungsstrategien zu ermöglichen. Die Entwicklung eines zuverlässigen Tiermodells ist dabei von zentraler Bedeutung. Diese Studie stellt ein verfeinertes Protokoll für die Induktion von postmenopausaler Osteosarkopenie bei Ratten durch bilaterale Ovariektomie vor, eine Methode, von der bekannt ist, dass sie das Auftreten von altersbedingtem Muskel- und Knochenverlust beschleunigt. In dieser Studie wurden Ratten im Alter von 12 Wochen nach Körpergewicht stratifiziert und nach dem Zufallsprinzip entweder einer Scheinoperationsgruppe oder einer ovariektomierten (OVX) Gruppe zugeteilt. Gewebeproben aus den Quadrizeps- und Trizepsmuskeln der linken Hintergliedmaße sowie des linken Oberschenkelknochens wurden 4, 8 und 12 Wochen nach der Operation systematisch entnommen. Dieser methodische Ansatz gewährleistet eine umfassende Bewertung der Auswirkungen der Ovariektomie auf die Muskel- und Knochengesundheit. Die histologische Beurteilung der Muskelfaseratrophie und der Femurmorphologie erfolgte mittels Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung, während die Knochenmineraldichte mittels Dual-Energie-Röntgenabsorptiometrie (DXA) quantifiziert wurde. Der zeitliche Verlauf des OS wurde in den oben genannten Intervallen akribisch überwacht und gab Einblicke in das dynamische Zusammenspiel zwischen Muskel- und Knochendegeneration. Dieses Modell spiegelt nicht nur die klinischen Manifestationen des OS genau wider, sondern dient auch als robuste Plattform für die Untersuchung neuartiger Therapieansätze und der ihnen zugrunde liegenden Mechanismen.

Osteosarkopenie ist eine vielschichtige degenerative Erkrankung, die die klinischen Manifestationen sowohl der Osteoporose als auch der Sarkopenie umfasst 1,2,3,4. Osteoporose, eine weit verbreitete Skeletterkrankung, ist gekennzeichnet durch eine verminderte Knochenmasse, eine beeinträchtigte Mikroarchitektur und eine erhöhte Anfälligkeit für Frakturen. Sarkopenie, oft auch als Muskelschwundsyndrom bezeichnet, ist gekennzeichnet durch eine Verringerung der Muskelkraft und -masse ^5,6. Maryams⁷ Ergebnisse zeigten, dass Osteosarkopenie das Sterberisiko bei Sarkopenie allein um 30 % und bei niedriger BMD allein um 8 % erhöhte. Untersuchungen haben gezeigt, dass 16,4 % der in einer Gemeinschaft lebenden Personen ab 60 Jahren von Osteosarkopenie betroffen sind⁸. In Südkorea wird die Inzidenz von Osteosarkopenie bei älteren Menschen ab 60 Jahren, die Hüftfrakturen erlitten haben, mit 27,2 % ^angegeben9. Personen mit OS sind einem höheren Risiko für Stürze, Frakturen, Krankenhausaufenthalte und Institutionalisierungen ausgesetzt, was das Gesundheitssystem und die Gesellschaft belastet^10,11. Angesichts der Schwere dieser Folgen ist es von entscheidender Bedeutung, effiziente Maßnahmen zur Prävention und Behandlung von OS zu entwickeln und umzusetzen. Trotz der Dringlichkeit ist die Forschung auf diesem Gebiet noch im Entstehen, und es gibt anhaltende Debatten über diagnostische Kriterien und die Wirksamkeit verschiedener Behandlungsmethoden. Die Entwicklung zuverlässiger Tiermodelle ist daher unerlässlich, um die Pathogenese des OS zu entschlüsseln und die molekularen Grundlagen aufzudecken, die zu wirksameren Behandlungsansätzen führen könnten.

Zu den derzeit häufig verwendeten Modellen für präklinische Studien zur Osteosarkopenie gehört das Alterungsmodell, das den menschlichen Alterungsprozess ohne medikamentöse Eingriffe simuliert. Dieser Ansatz ist näher am natürlichen Prozess und kostengünstig; Sie erfordert jedoch einen erheblichen Zeitaufwand für die Reifung¹². Die Methode der Injektion chemischer Medikamente bietet bestimmte Vorteile, wie z. B. einen kurzen Modellierungszyklus, stabile Ergebnisse und niedrige Kosten. Sie bringt jedoch auch Herausforderungen mit sich, darunter die genaue Bestimmung der Hormondosis, die für die Injektion erforderliche technische Fertigkeit und die variablen Wirkungen hormoneller Interventionen^13,14. Gentechnische Modelle können gentechnisch veränderte Organismen beinhalten, die sowohl genetisch defekt als auch kostspielig sein können. Obwohl diese Modelle sehr spezifisch sind, sind sie deutlich komplexer und teurer in der Herstellung¹⁵. Nichtgebrauchsmodelle simulieren die Auswirkungen längerer Bettruhe auf klinische Patienten¹⁶. Nichtgebrauchsmodelle sind effektiv und kosteneffizient, um Muskelabbau zu bekämpfen, sind aber mit Komplikationen wie Blutgerinnseln und Druckgeschwüren verbunden. Diese Modelle werden routinemäßig überwacht, um Gliedmaßennekrosen^17,18 und Modelle mit Hormonmangel zu verhindern; In der wissenschaftlichen Gemeinschaft herrscht Einigkeit darüber, dass die bilaterale Ovariektomie eine wirksame Methode zur Etablierung eines Tiermodells für Osteoporose darstellt^19,20.

Die Forschung deutet darauf hin, dass Knochen- und Muskelgewebe auch durch autokrine, endokrine und parakrine Mechanismen miteinander interagieren können²¹. Die Ansammlung von Fettgewebe in Muskeln und Knochenmark dient als Indikator für eine verminderte Knochen- und Muskelmasse im Rahmen der Osteosarkopenie². Sarkopenie bei älteren Erwachsenen ist direkt mit einer Verringerung der Knochendichte und der Verschlechterung der Knochenmikroarchitektur verbunden. Darüber hinaus stellt eine verminderte Muskelmasse einen unabhängigen Risikofaktor für den Abbau der Knochenmikrostruktur^{dar 22}. Diese Methodik wurde als praktikable Strategie für die Modellierung der Sarkopenie anerkannt ^23,24, die möglicherweise als kombiniertes Modell für beide Zustände dienen könnte²⁵. Trotz des begrenzten Forschungsergebnisses über die Anwendung der Ovariektomie als Mittel zur Induktion von Osteosarkopenie zeigt dieser Ansatz eine potenzielle Wirksamkeit. Zu den Vorteilen des Einsatzes der Ovariektomie in präklinischen Studien gehören ein schneller Modellierungsprozess, der Wegfall pharmakologischer Eingriffe, die Erstellung eines stabilen experimentellen Modells, eine einfache Implementierung und Kosteneffizienz.

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, das Verfahren zur Erstellung eines präklinischen Modells bei weiblichen Ratten durch die Entfernung eines Segments sowohl der Eileiter als auch der Eierstöcke bei nicht schwangeren Personen zu beschreiben. Dieser Ansatz dient als wertvolles Instrument, um die molekularen Grundlagen des OS zu untersuchen und den therapeutischen Nutzen von Interventionen in einem kontrollierten experimentellen Setting zu bewerten.

Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (n = 36) im Alter von 12 Wochen und mit einem Gewicht von etwa 200-240 g wurden einzeln in beatmeten Käfigen in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Tierraum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Sie hatten freien Zugang zu SPF-Futter und sterilem Wasser. Die Ratten durften sich vor den Experimenten eine Woche lang an die Umwelt gewöhnen. Mittels Zufallszuteilung wurden die Ratten 4, 8 und 12 Wochen nach der Operation in ovariektomierte (OVX) Gruppen (jeweils mit 6 Ratten) und Scheingruppen (mit je 6 Ratten) eingeteilt. Alle tierischen Eingriffe wurden nach den genehmigten Richtlinien des Tierschutzkomitees der Liaoning Universität für Traditionelle Chinesische Medizin (Nr. 21000042021040) durchgeführt.

1. Ovariektomie bei Ratten

HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete chirurgische Gerät ist in Abbildung 1 zu sehen.

1. Halten Sie die Ratten im SPF-Tierraum und befolgen Sie alle notwendigen Verfahren mit sterilisierten Geräten in einer sterilen Umgebung.
2. Mischen Sie Natrium-Pentobarbital, ein weißes Pulver, mit destilliertem Wasser oder einer 0,9%igen normalen Kochsalzlösung, um eine Anästhesielösung herzustellen. Die Standarddosis beträgt 30 mg/kg; Füllen Sie die Spritze entsprechend.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass die Lösung instabil ist und sofort verwendet werden sollte. Bereiten Sie die erforderliche Menge für jeweils ein Experiment vor.
3. Hebe den Hinterleib der Ratte über ihren Kopf, um die Eingeweide in den Oberbauch zu verlagern. Positionieren Sie mit der dominanten Hand eine Spritze 1-1,5 cm von der linken (oder rechten) Seite der Mittellinie des Bauches entfernt und führen Sie sie in einem Winkel von 45° in den Körper der Ratte ein. Nachdem die Arzneimittellösung verabreicht wurde, drehen Sie die Nadel und ziehen Sie sie dann zurück.
4. Überwachen Sie nach der Verabreichung der Narkose sorgfältig die Atmung der Ratte und kneifen Sie ihre Zehen zusammen, um zu bestätigen, dass sie vollständig betäubt ist.
   HINWEIS: Wenn es Anzeichen von Krämpfen oder Krämpfen gibt, ist es ratsam, länger zu warten, bevor Sie fortfahren.
5. Positionieren Sie die Ratte auf dem Operationstisch, sichern Sie ihre Gliedmaßen und entfernen Sie die Haare auf beiden Seiten ihres Rückens mit einem Trimmer (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Wenn der Haarentfernungseffekt nicht ideal ist, kann Haarentfernungscreme zur Haarentfernung verwendet werden.
6. Desinfizieren Sie den Bereich, an dem die Haare entfernt wurden, mit Wattebällchen, die in Jod getränkt sind.
   HINWEIS: Der Prozess der chirurgischen Desinfektion besteht darin, von der Mitte aus zu beginnen und sich in einem kreisförmigen Muster nach außen zu bewegen, das in der Regel dreimal wiederholt wird.
7. Machen Sie einen Schnitt auf dem Rücken, etwa 1,0 cm von der Mittellinie entfernt. Machen Sie den Schnitt nahe der Verbindungsstelle zwischen der Krümmung des Brustkorbs und dem Rand der Wirbelsäule, etwas tiefer um 0,5-1 cm, indem Sie Haut, Faszie und Muskeln auf beiden Seiten trennen (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Für den Zugang in die Bauchhöhle durch die schwächere Muskelschicht der hinteren Bauchdecke wird der Schnitt so gering wie möglich gehalten.
8. Den Eierstock zu finden, kann anfangs eine Herausforderung sein. Beginnen Sie damit, den Eileiter zu lokalisieren und ihn bis zum Ende des Eierstocks zu verfolgen, der von einer Schicht aus losem Fettgewebe umhüllt ist.
   HINWEIS: Der rechte Eierstock befindet sich an der Seite des 4. bis 5. Lendenwirbels, 7-12 mm hinter der Niere und 15 mm von der Mittellinie entfernt. Der linke Eierstock befindet sich seitlich des 5. bis 6. Lendenwirbels, 3-5 mm hinter der Niere und 11 mm von der Mittellinie entfernt.
9. Heben Sie den Eierstock und das Ende des Eileiters vorsichtig aus dem Körper (Abbildung 2C). Legen Sie die hämostatische Pinzette an der engsten Stelle zwischen dem Gebärmutterende und dem Eierstock an. Binden Sie ihn mit einem chirurgischen Faden ab und schneiden Sie dann den Eierstock mit einer Schere vollständig heraus.
   HINWEIS: Es ist wichtig, während des Eingriffs vorsichtig mit dem Eileiter und der Gebärmutter umzugehen und übermäßiges Ziehen zu vermeiden. Die Ligatur, die vor der Ovariektomie verwendet wird, muss fest befestigt sein, da das weiche Lipidgewebe um den Eierstock herum leicht dazu führen kann, dass sie sich löst. Diese Vorsichtsmaßnahme ist notwendig, um postoperative Blutungen zu verhindern, die zum Tod der Ratten führen könnten. In der Scheingruppe wurde Fettgewebe gleichen Volumens und gleicher Größe in der Nähe des Eierstocks exzidiert, gefolgt von der Naht des Muskels und der Haut.
10. Lösen Sie die hämostatische Pinzette und führen Sie die Gebärmutter sanft in die Bauchhöhle zurück.
11. Verabreichen Sie Penicillin auf die Bauchwunden, an denen die Eierstöcke und Eileiter ligaturiert sind, um Infektionen zu vermeiden.
    HINWEIS: Verabreichen Sie 80.000 Einheiten/Ratte Penicillin einmal täglich an 3 aufeinanderfolgenden Tagen.
12. Vernähen Sie die Haut- und Muskelschichten einzeln (Größe 3-0) (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Die Sterilisation sollte 24-48 Stunden nach der Operation im Abstand von 1-2 Tagen durchgeführt werden.
13. Setzen Sie die Ratte wieder in einen desinfizierten Käfig und überwachen Sie sie, bis sie nach der Narkose wieder vollständig zu Bewusstsein kommt.
    HINWEIS: Setzen Sie die Wärmeunterstützung während des Eingriffs fort, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.
14. Um eine Wundinfektion zu vermeiden, verabreichen Sie den Ratten in jeder Gruppe an 3 aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich eine intramuskuläre Injektion von Penicillin-Natrium 80.000 Einheiten/Ratte²⁶.

2. Entnahme von Knochengewebe und Muskelgewebe

HINWEIS: Ratten wurden mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (100-200 mg/kg) 4, 8 und 12 Wochen nach der Modellierungsoperation euthanasiert. Insgesamt wurden 36 Proben entnommen.

1. Legen Sie den Trizeps brachii und die Quadrizepsmuskulatur der linken Wade frei. Identifizieren und präparieren Sie diese Muskeln sorgfältig an ihren Ursprungs- und Endpunkten, um ihre Integrität zu erhalten. Erfassen und berechnen Sie anschließend den Durchschnitt der Nassgewichte der Muskeln, um die Nassgewichtskoeffizienten der Muskeln zu bestimmen.
   HINWEIS: Körpergewicht des Tieres und Nassgewichtskoeffizient der Skelettmuskulatur = Nassgewicht der Rattenmuskulatur/Körpergewicht.
2. Löse den Femur vollständig, indem du die Gelenkkapsel entlang des Femurs nach oben schneidest. Beseitigen Sie dann das nahe gelegene Muskel- und Bändergewebe.

3. Pathologische Untersuchung

1. Tauchen Sie das Muskelgewebe für eine Dauer von 24 Stunden in ein Gefäß mit einer 10%igen neutralen gepufferten Formalinlösung. Spülen Sie anschließend das Muskelgewebe ausgiebig unter fließendem Wasser ab, um das Fixiermittel zu entfernen.
2. Legen Sie den linken Oberschenkelknochen 1 Woche lang in eine 4%ige Paraformaldehydlösung und weichen Sie ihn dann in einer ausreichenden Menge Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Entkalkungslösung ein, um Kalziumablagerungen zu entfernen, wobei der Puffer täglich gewechselt wird.
3. Messen Sie die Knochenmineraldichtewerte mit einem Dual-Energie-Röntgen-Absorptiometrie (DXA) Knochendichtemessgerät. Platzieren Sie den Oberschenkelknochen in einer Röntgenaufnahme mit zwei Energien. Stellen Sie die Messgenauigkeit auf Fein ein, stellen Sie den Modus auf den kleintierspezifischen Modus ein und analysieren Sie die BMD von Rattenfemuren mit der mitgelieferten BMD-Analysesoftware.
4. Legen Sie die Probe in Paraffinwachs. Schnitte der Proben für die histologische Routineuntersuchung²⁷.

4. Statistische Auswertung

1. Stellen Sie die kontinuierlichen Variablen als Mittelwert ±± Standardabweichung (SD) dar und vergleichen Sie die beiden Gruppen mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test. Alle statistischen Analysen folgten einem zweiseitigen Ansatz, wobei die statistische Signifikanz auf P < 0,05 festgelegt wurde. Verwenden Sie eine geeignete Datenanalysesoftware, um Datenanalysen durchzuführen.

Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung des bilateralen Ovariektomieverfahrens zur Etablierung eines Rattenmodells für Osteosarkopenie. Abbildung 3 zeigt eine Abnahme des Nassgewichtskoeffizienten des Quadrizepsmuskels in der OVX-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe. Obwohl es 4 Wochen nach der Operation keine statistisch signifikante Varianz in der BMD zwischen den beiden Gruppen gab, war die BMD in der OVX...

Das bilaterale ovariektomierte Tiermodell ist entscheidend für die Aufklärung der Mechanismen, die der Osteosarkopenie zugrunde liegen, und die Bewertung möglicher therapeutischer Interventionen. Ovariektomie-induzierte Osteoporose bei Ratten, die den abrupten Abfall des Östrogenspiegels bei postmenopausalen Frauen widerspiegelt, wird häufig als Modell für die Osteoporoseforschung verwendet. Darüber hinaus hat die Forschung einen signifikanten Zusammenhang zwischen Osteoporose und...

Jeder Autor erklärt, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von (1) der National Nature Science Foundation (82305275) unterstützt. (2) Programm der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Liaoning (2022-YGJC-80 und 2022-YGJC-79). (3) Aufbauprojekt für die Schlüsseldisziplin der Chinesischen Medizin auf hohem Niveau der Nationalen Verwaltung der TCM (zyyzdxk-2023040).