إنشاء نموذج فئران لتقمص العظم عن طريق استئصال المبيض

يحدد هذا البروتوكول الحالي إجراء لإنشاء نموذج فئران من ساركوبينيا العظم باستخدام استئصال المبيض.

يتميز العظم الساركيبيني (OS) ، وهو اضطراب تنكسي معقد ، بالانخفاض المتزامن في كتلة العضلات الهيكلية وكثافة المعادن في العظام (BMD) ، مما يشكل خطرا صحيا هائلا على كبار السن. على الرغم من أهميتها السريرية ، إلا أن الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء OS ليست مفهومة تماما ، مما يؤكد ضرورة فهم أعمق لمسبراته لتسهيل استراتيجيات العلاج الفعالة. يعد تطوير نموذج حيواني موثوق به أمرا محوريا في هذا المسعى. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا دقيقا لتحريض ساركوبينيته العظمية بعد انقطاع الطمث في الفئران من خلال استئصال المبيض الثنائي ، وهي طريقة معروفة بتسريع ظهور فقدان العضلات والعظام المرتبط بالعمر. في هذه الدراسة ، تم تقسيم الفئران التي تبلغ أعمارها 12 أسبوعا إلى طبقات حسب وزن الجسم وتم تخصيصها عشوائيا إما إلى مجموعة عمليات وهمية أو مجموعة استئصال المبيض (OVX). تم جمع عينات الأنسجة من عضلات الفخذ والعضلة ثلاثية الرؤوس في الطرف الخلفي الأيسر ، وكذلك عظم الفخذ الأيسر ، بشكل منهجي في 4 و 8 و 12 أسبوعا بعد الجراحة. يضمن هذا النهج المنهجي تقييما شاملا لآثار استئصال المبيض على صحة العضلات والعظام. تم إجراء التقييم النسيجي لضمور ألياف العضلات ومورفولوجيا الفخذ باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، بينما تم قياس كثافة المعادن في العظام باستخدام قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DXA). تمت مراقبة التقدم الزمني لنظام التشغيل بدقة في الفترات المذكورة أعلاه ، مما يوفر نظرة ثاقبة للتفاعل الديناميكي بين تنكس العضلات والعظام. لا يعكس هذا النموذج بدقة المظاهر السريرية لنظام التشغيل فحسب ، بل يعمل أيضا كمنصة قوية للتحقيق في الأساليب العلاجية الجديدة وآلياتها الأساسية.

ساركوبيني العظم هو حالة تنكسية متعددة الأوجه تغلف المظاهر السريرية لكل من هشاشة العظام والساركوبينيا^1،2،3،4. يتميز هشاشة العظام ، وهو اضطراب هيكلي سائد ، بتناقص كتلة العظام ، وضعف الهندسة المعمارية الدقيقة ، وزيادة التعرض للكسور. يتميز ساركوبينيا ، الذي يشار إليه غالبا باسم متلازمة هزال العضلات ، بانخفاض في قوة العضلات وكتلتها^5،6. كشفت النتائج التي توصلت إليها مريم⁷ أن ساركوبينيا العظم زاد من خطر الوفاة بنسبة 30٪ على ساركوبينيا وحدها وبنسبة 8٪ على انخفاض كثافة العظام وحدها. أظهرت الأبحاث أن 16.4٪ من الأفراد الذين يعيشون في المجتمع الذين تبلغ أعمارهم 60 عاما فما فوق يتأثرون بالساركوبينيا^{العظمي 8}. في كوريا الجنوبية ، تم الإبلاغ عن حدوث الساركوبينيا العظمي بين كبار السن الذين تبلغ أعمارهم 60 عاما فما فوق والذين أصيبوا بكسور في الورك بنسبة 27.2٪ ⁹. يواجه الأفراد الذين يعانون من OS مخاطر أعلى من السقوط والكسور والاستشفاء والإقامة في المؤسسات ، مما يثقل كاهل نظام الرعاية الصحية والمجتمع^10،11. نظرا لخطورة هذه العواقب ، من الأهمية بمكان تطوير وتنفيذ تدابير فعالة للوقاية من OS وعلاجه. على الرغم من الحاجة الملحة ، لا يزال البحث في هذا المجال ناشئا ، مع وجود مناقشات مستمرة حول معايير التشخيص وفعالية طرق العلاج المختلفة. وبالتالي ، فإن تطوير نماذج حيوانية موثوقة أمر ضروري لتشريح التسبب في OS والكشف عن الأسس الجزيئية التي يمكن أن تفيد مناهج العلاج الأكثر فعالية.

حاليا ، تشمل النماذج شائعة الاستخدام للدراسات قبل السريرية حول ساركوبينيا العظم نموذج الشيخوخة ، الذي يحاكي عملية الشيخوخة البشرية دون تدخل دوائي هذا النهج أقرب إلى العملية الطبيعية وفعال من حيث التكلفة. ومع ذلك ، فإنه يتطلب استثمارا كبيرا للوقت للنضج¹². توفر طريقة حقن الدواء الكيميائي فوائد معينة ، مثل دورة النمذجة القصيرة والنتائج المستقرة والتكلفة المنخفضة. ومع ذلك ، فإنه يمثل أيضا تحديات ، بما في ذلك التحديد الدقيق لجرعة الهرمون ، والمهارة التقنية المطلوبة للحقن ، والتأثيرات المتغيرة للتدخلات الهرمونية^13،14. قد تتضمن نماذج الهندسة الوراثية كائنات معدلة وراثيا يمكن أن تكون معيبة وراثيا ومكلفة. على الرغم من أن هذه النماذج محددة للغاية ، إلا أنها أكثر تعقيدا وتكلفة لإنتاج¹⁵. تحاكي نماذج الإهمال آثار الراحة في الفراش لفترات طويلة على المرضى^{السريريين 16}. تعتبر نماذج الإهمال فعالة وفعالة من حيث التكلفة لمعالجة فقدان العضلات ولكنها مرتبطة بمضاعفات مثل جلطات الدم وتقرحات الضغط. تتم مراقبة هذه النماذج بشكل روتيني لمنع نخر الأطراف^17،18 والنماذج التي تعاني من نقص الهرمونات. هناك اتفاق سائد داخل المجتمع العلمي على أن استئصال المبيض الثنائي بمثابة طريقة فعالة لإنشاء نموذج حيواني لهشاشة العظام^19،20.

تشير الأبحاث إلى أن أنسجة العظام والعضلات يمكن أن تتفاعل أيضا مع بعضها البعض من خلال آليات الأوتوكرين والغدد الصماء والباراكرين²¹. يعمل تراكم الأنسجة الدهنية في العضلات ونخاع العظام كمؤشر على انخفاض كتلة العظام والعضلات في سياق ساركوبينيا^{العظم 2}. يرتبط الساركوبينيا لدى كبار السن ارتباطا مباشرا بانخفاض كثافة العظام وتدهور الهندسة المعمارية الدقيقة للعظام. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل كتلة العضلات المتناقصة كعامل خطر مستقل لتدهور البنية المجهرية^{للعظام 22}. تم الاعتراف بهذه المنهجية كاستراتيجية قابلة للتطبيق لنمذجة ساركوبينيا^23،24 ، والتي يمكن أن تكون بمثابة نموذج مشترك لكلا الحالتين²⁵. على الرغم من محدودية مجموعة الأبحاث المتعلقة بتطبيق استئصال المبيض كوسيلة للحث على ساركوبينيا العظم ، فإن هذا النهج يوضح الفعالية المحتملة. تشمل فوائد استخدام استئصال المبيض في الدراسات قبل السريرية عملية نمذجة سريعة ، والقضاء على التدخلات الدوائية ، وإنشاء نموذج تجريبي مستقر ، وتنفيذ مباشر ، وفعالية من حيث التكلفة.

تهدف الدراسة الحالية إلى تحديد إجراءات إنشاء نموذج قبل السريري في إناث الفئران من خلال إزالة جزء من كل من قناتي فالوب والمبيضين لدى الأفراد غير الحوامل. يعمل هذا النهج كأداة قيمة للتحقيق في الأسس الجزيئية ل OS ولتقييم الفوائد العلاجية للتدخلات في بيئة تجريبية خاضعة للرقابة.

تم إيواء إناث فئران Sprague Dawley (ن = 36) ، التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا وتزن حوالي 200-240 جراما ، بشكل فردي في أقفاص جيدة التهوية في غرفة خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة. كان لديهم حرية الوصول إلى علف SPF والمياه المعقمة. سمح للفئران بالتأقلم مع البيئة لمدة أسبوع قبل التجارب. باستخدام التخصيص العشوائي ، تم تقسيم الفئران إلى مجموعات مكتملة المبيض (OVX) (لكل منها 6 فئران) ومجموعات زائفة (لكل منها 6 فئران) لمدة 4 و 8 و 12 أسبوعا بعد الجراحة. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للإرشادات المعتمدة للجنة رعاية في جامعة لياونينغ للطب الصيني التقليدي (رقم 21000042021040).

1. استئصال المبيض في الفئران

ملاحظة: الجهاز الجراحي المستخدم في هذا البروتوكول موجود في الشكل 1.

1. احتفظ بالفئران في غرفة SPF واتبع جميع الإجراءات اللازمة باستخدام معدات معقمة في بيئة معقمة.
2. اخلطي بنتوباربيتال الصوديوم ، وهو مسحوق أبيض ، مع الماء المقطر أو محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪ لعمل محلول مخدر. الجرعة القياسية هي 30 مجم / كغ. املأ المحقنة وفقا لذلك.
   ملاحظة: من المهم ملاحظة أن المحلول غير مستقر ويجب استخدامه على الفور. قم بإعداد الكمية المطلوبة لتجربة واحدة في كل مرة.
3. ارفع بطن الجرذ فوق رأسه لنقل الأحشاء إلى الجزء العلوي من البطن. باستخدام اليد المهيمنة ، ضع حقنة على بعد 1-1.5 سم من الجانب الأيسر (أو الأيمن) من خط الوسط للبطن وأدخلها بزاوية 45 درجة في جسم الفئران. بعد إعطاء محلول الدواء ، قم بتدوير الإبرة ثم اسحبها.
4. بعد إعطاء التخدير ، راقب تنفس الفئران بعناية واضغط على أصابع قدميه للتأكد من أنه مخدر تماما.
   ملاحظة: إذا كانت هناك أي علامات على التشنجات أو التشنجات ، فمن المستحسن الانتظار لفترة أطول قبل المتابعة.
5. ضع الجرذ على طاولة العمليات ، وقم بتأمين أطرافه ، وقم بإزالة الشعر على جانبي ظهره باستخدام أداة تشذيب (الشكل 2 أ).
   ملاحظة: إذا لم يكن تأثير إزالة الشعر مثاليا ، فيمكن استخدام كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر.
6. تطهير المنطقة التي تمت إزالة الشعر فيها باستخدام كرات قطنية مبللة باليود.
   ملاحظة: تتضمن عملية التطهير الجراحي البدء من المركز والتحرك للخارج بنمط دائري ، وعادة ما يتكرر ثلاث مرات.
7. قم بعمل شق في الظهر ، على بعد حوالي 1.0 سم من خط الوسط. قم بعمل شق قريب من المنعطف بين انحناء القفص الصدري وحدود العمود الفقري ، بمقدار 0.5-1 سم عن طريق فصل الجلد واللفافة والعضلات على كلا الجانبين (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: للوصول إلى تجويف البطن من خلال الطبقة العضلية الأضعف لجدار البطن الخلفي ، يتم الاحتفاظ بالشق في أدنى حد ممكن.
8. قد يكون العثور على المبيض أمرا صعبا في البداية. ابدأ بتحديد موقع قناة البيض وتتبعها إلى الطرف النهائي للمبيض ، المغطى بطبقة من الأنسجة الدهنية الرخوة.
   ملاحظة: يتم وضع المبيض الأيمن على جانب الفقرات القطنية من 4 إلى 5 ، 7-12 مم خلف الكلى و 15 مم بعيدا عن خط الوسط. يقع المبيض الأيسر على جانب الفقرات القطنية من 5 إلى 6 ، 3-5 مم خلف الكلى و 11 ملم من خط الوسط.
9. ارفع المبيض ونهاية قناة البيض بعناية من الجسم (الشكل 2 ج). ضعي ملقط مرقئ في المنطقة الأكثر انقباضا بين نهاية الرحم والمبيض. استخدم خيطا جراحيا لربطه ، ثم استئصال المبيض بالكامل بالمقص.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون لطيفا عند التعامل مع قناة البيض والرحم أثناء العملية ، وتجنب السحب المفرط. يجب تأمين الرباط المستخدم قبل استئصال المبيض بإحكام ، حيث يمكن أن يتسبب النسيج الدهني الرخو حول المبيض في فك الأنسجة الدهنية بسهولة. هذا الاحتياط ضروري لمنع نزيف ما بعد الجراحة ، والذي قد يؤدي إلى موت الفئران. في المجموعة الوهمية ، تم استئصال الأنسجة الدهنية ذات الحجم والحجم المتساوي المجاور للمبيض ، متبوعة بخياطة العضلات والجلد.
10. حرر ملقط مرقئ وأعد الرحم برفق إلى تجويف البطن.
11. يمرر البنسلين على جروح البطن حيث يتم ربط المبايض وقناتي فالوب لتجنب العدوى.
    ملاحظة: قم بإدارة البنسلين 80,000 وحدة / جرذ مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام متتالية.
12. خياطة فردية (حجم 3-0) طبقات الجلد والعضلات (الشكل 2 د).
    ملاحظة: يجب إجراء التعقيم بعد 24-48 ساعة بعد الجراحة ، متباعدة بين 1-2 أيام.
13. ضع الجرذ مرة أخرى في قفص معقم وراقبه حتى يستعيد وعيه تماما من التخدير.
    ملاحظة: استمر في توفير الدعم الحراري أثناء العملية حتى يتعافى تماما من التخدير.
14. لتجنب عدوى الجرح ، قم بإعطاء الفئران في كل مجموعة بحقن عضلي من البنسلين الصوديوم 80،000 وحدة / فأر مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام متتالية²⁶.

2. جمع أنسجة العظام والأنسجة العضلية

ملاحظة: تم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من البنتوباربيتال الصوديوم (100-200 مجم / كجم) في 4 و 8 و 12 أسبوعا بعد جراحة النمذجة. تم جمع ما مجموعه 36 عينة.

1. كشف العضلة ثلاثية الرؤوس العضدية وعضلات الفخذ في ربلة الساق اليسرى. حدد هذه العضلات وتشريحها بعناية عند نقاط منشأها ونقطة النهاية للحفاظ على سلامتها. بعد ذلك ، قم بتسجيل وحساب متوسط الأوزان الرطبة للعضلات لتحديد معاملات الوزن الرطب للعضلات.
   ملاحظة: وزن جسم ومعامل الوزن الرطب للعضلات الهيكلية = الوزن الرطب لعضلة الفئران / وزن الجسم.
2. افصل عظم الفخذ بالكامل عن طريق تقطيع كبسولة المفصل لأعلى على طول عظم الفخذ. ثم القضاء على أنسجة العضلات والأربطة القريبة.

3. الفحص المرضي

1. اغمر أنسجة العضلات في وعاء يحتوي على محلول فورمالين محايد 10٪ لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، اشطف أنسجة العضلات على نطاق واسع تحت الماء المتدفق لإزالة المثبت.
2. ضع عظم الفخذ الأيسر في محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لمدة أسبوع واحد ، ثم انقعه في كمية كافية من محلول إزالة الكلس من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) لإزالة رواسب الكالسيوم ، مع تغيير المخزن المؤقت يوميا.
3. قم بقياس قيم كثافة المعادن في العظام باستخدام مقياس كثافة العظام بالأشعة السينية ثنائي الطاقة (DXA). ضع عظم الفخذ في أشعة سينية مزدوجة الطاقة. اضبط دقة القياس على Fine ، واضبط الوضع على الوضع الصغير المخصص للحيوانات الصغيرة ، وقم بتحليل BMD لعظم الفخذ باستخدام برنامج تحليل BMD المصاحب.
4. ضع العينة في شمع البارافين. قسم العينات للفحص النسيجي الروتيني²⁷.

4. التحليل الإحصائي

1. اعرض المتغيرات المستمرة كمتوسط ±± الانحراف المعياري (SD) وقارن بين المجموعتين باستخدام اختبار t العينة المستقلة. اتبعت جميع التحليلات الإحصائية نهجا ذا وجهين ، مع تحديد الدلالة الإحصائية عند P < 0.05. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب لإجراء تحليلات البيانات.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لإجراء استئصال المبيض الثنائي لإنشاء نموذج الفئران من تقبيض العظم. يوضح الشكل 3 انخفاضا في معامل الوزن الرطب لعضلة الفخذ في مجموعة OVX مقارنة بمجموعة الزائف. على الرغم من عدم وجود تباين يعتد به إحصائيا في BMD ...

يعد النموذج الحيواني الثنائي لاستئصال المبيض مفيدا في توضيح الآليات الكامنة وراء ساركوبينيا العظم وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. هشاشة العظام الناجمة عن استئصال المبيض في الفئران ، والتي تعكس الانخفاض المفاجئ في مستويات هرمون الاستروجين التي تظهر لدى النساء بعد ?...

يعلن كل مؤلف عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

هذا العمل مدعوم بمنح من (1) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (82305275). (2) برنامج مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة لياونينغ (2022-YGJC-80 و 2022-YGJC-79). (3) مشروع بناء الانضباط الرئيسي للطب الصيني عالي المستوى للإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي (zyyzdxk-2023040).