全面分析表现出坏死、细胞凋亡和血小板活化特征的促凝血小板

我们的研究重点是了解血栓形成前状态（例如抗磷脂综合征和癌症）期间的血小板代谢和信号传导，目的是确定新的生物标志物和治疗靶点。我们小组一直处于最近对血小板代谢如何促进血小板活化和血栓形成的兴趣激增的最前沿。准确表征患者循环中的血小板活化状态以确定血栓形成的风险以及抗血小板药物的治疗效果仍然是一项重大挑战。

有氧糖酵解、磷酸戊糖途径和脂肪酸的 β 氧化已被揭示为血小板中标志性的能量代谢途径，其治疗靶向的潜力已被确立。该方案有助于识别和准确表征促凝血小板，不同于促凝血小板，以及因细胞凋亡或坏死而发生细胞死亡的血小板。首先，通过在 100 微升血小板悬液中加入 0.5 微升 0.5 摩尔原液氯化钙溶液，用 2.5 毫摩尔钙补充洗涤过的人血小板。

保持一部分血小板不刺激，并在室温下用凝血酶和惊厥药的组合刺激剩余的部分 15 分钟。刺激后，向 100 μL 刺激的血小板悬液中加入 1 μL 膜联蛋白 V、包装 1 和抗 CD62P 抗体。将血小板在室温下避光孵育 30 分钟。

30 分钟后，加入等体积的 2% 福尔马林固定血小板，然后通过流式细胞术分析样品以定量促凝血小板。对于血小板的制备，将洗涤过的人血小板稀释至每毫升 100 万血小板的浓度，并补充 2.5 毫摩尔钙。用 5 微摩尔 ROD2 标记血小板以进行线粒体钙检测，并在黑暗中孵育 30 分钟。

对于用于 caspase 活化测定的血小板的制备，在用钙补充血小板并刺激一部分后，将活性 caspase 标记模具添加到刺激的血小板悬液中。将血小板在黑暗中孵育 30 分钟。30 分钟后，加入等体积的 2% 福尔马林固定血小板，然后通过流式细胞术分析血小板。

结果表明，凝血酶诱导表达磷脂酰丝氨酸和 P-选择素的血小板比例呈剂量依赖性增加。凝血酶刺激还导致血小板中线粒体钙水平的时间依赖性增加。然而，凝血酶刺激导致血小板线粒体膜电位降低。

凝血酶刺激激活血小板中的 caspase-8 但不激活 caspase-3 或 7。