体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型

该协议描述了第一个顶端出入培养皿模型，并且在建立用于口服给药的潜在疗法的体外建模时，是对基础外侧出肠样培养皿模型的关键改进。这种方法允许进入肠样的顶端表面。化合物可以添加到细胞培养基中，并且化合物像在体内一样被顶端吸收。

有兴趣建立肠道炎症的体外系统以测试潜在口服疗法的研究人员可能会发现这种技术特别有用。来自不同年龄和物种的组织可能需要进一步标准化。因此，患者在建立极性逆转时可能需要时间。

为了逆转 3D 肠样的极性，从已建立的 3D 基底外侧肠的 24 孔板的每个孔中吸出培养基。向 24 孔板的每个孔中加入 500 微升 5 毫摩尔冰冷、EDTA 或 PBS，并通过用 P 200 移液器上下移液五到六次，轻轻机械地破坏基底膜提取物或细胞外基质圆顶。将四个孔的内容物转移到15毫升编年史管中。

然后在管中加入八毫升冰冷的EDTA斜线PBS。以相同的方式转移剩余的20个孔。将试管在 4 摄氏度下以 330 RPM 的旋转平台或摇床孵育一小时。

孵育后离心管并从每个管中弃去上清液。将颗粒与五毫升 DMEM F12 混合并清洗。然后离心细胞悬液并除去上清液，然后将12毫升无抗生素培养基加入管中，确保细胞沉淀重悬。

将500微升肠悬浮液移入每孔24孔的超低附着板中。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两到五天或直到肠极性反转。在弃权的第一天，将24孔板的四个孔的内容物转移到1.5毫升微量离心管中。

对所有所需的孔重复此操作，每次处理都在单独的管中。离心管并在室温下将沉淀重悬于300微升4%的醛固定剂中。30分钟后，用500微升PBS洗涤颗粒。

向试管中加入 500 微升 0.1% Triton X 100。将试管在室温下孵育一小时。接下来，将试管放在 200 RPM 的旋转器或摇床上 15 分钟，温度为 2 至 8 摄氏度。

最后一次孵育后，在PBS T中加入500微升10%NDS，并在室温下孵育45分钟。在孵育过程中，制备一抗溶液。第二天，根据颗粒的大小向管中加入250至500微升PBS T，并将它们以200 RPM的速度在2至8摄氏度下放置在旋转器或摇床上一小时。

加入200微升二抗溶液，并在黑暗中将试管在2至8摄氏度下孵育。第二天，通过旋转试管并除去100微升上清液来进行安装染色的顶端肠。将细胞重悬于剩余的100微升上清液中，并将细胞悬液转移到500微升管中。

将试管在小型离心机中离心20秒。除去上清液并将沉淀重悬于100微升室温远红核酸染色剂中。孵育20分钟后，离心细胞并将沉淀重悬于100微升PBS中。

第二次洗涤和离心后，除去70微升上清液并将沉淀重悬于剩余体积的PBS中。然后将细胞悬液转移到贴有标签的 24 x 60 毫米盖玻片上。将 75 微升封片剂直接涂在试样上，并用移液器吸头去除任何气泡。

在黑暗中固化过夜后，在盖玻片上涂上一层薄薄的甘油，然后将盖玻片安装到载玻片上并轻轻按入到位。点击以去除盖玻片和幻灯片之间的任何气泡。让盖玻片在室温下在黑暗中凝固两个小时，然后用共聚焦显微镜以20倍放大倍率对肠样进行成像。

对于肠样治疗，如文本手稿中所述，在培养皿模型中建立根尖坏死性小肠结肠炎 24 小时。在进行测定之前，从每个孔中取出100微升培养基，留下剩余的400微升。向每个孔中加入400微升细胞活力测定试剂。

在摇板器上以200 RPM剧烈混合内容物五分钟，以诱导细胞裂解。接下来，将200微升转移到96孔透明底板的单孔中。对剩余的600微升重复此操作，每孔创建四个技术重复。

使用能够发光的酶标仪，以0.25毫秒积分记录值，并比较处理之间的相对值。对照组代表性的免疫荧光染色证实了细胞核向管腔的顶端定位和上皮外缘的反面检测。与对照组相比，单独暴露于脂质多糖、肿瘤坏死α或缺氧不会诱导大细胞形态E-钙粘蛋白或反派定位或荧光强度的明显变化。

用脂肪多糖或肿瘤坏死α联合缺氧治疗会破坏上皮结构，并显示出ECA听力丧失和恶棍染色所揭示的粘附连接和刷状边界蛋白表达的显着丧失。顶端细胞活力在常氧或缺氧条件下测定。在常氧条件下，与对照相比，脂多糖或肿瘤坏死α没有显着影响类肠的细胞活力。

然而，与单独缺氧相比，在脂肪多糖或肿瘤坏死α联合缺氧中观察到活力显着降低。同时建立顶端出盘模式。请记住将EDTA保存在细胞悬液冰冷中。

这将增强极性反转，并确保所有ECM都正确液化和去除。其他下游应用，如QPCR、RNA-seq、蛋白质印迹或屏障通透性的功能评估，可以进一步进行，以表征缺氧时对炎症信号的反应。