يصف هذا البروتوكول أول نموذج قمي خارج الطبق وهو تحسن حاسم على النماذج القاعدية الجانبية المعوية داخل الطبق عند إنشاء نمذجة في المختبر للعلاجات المحتملة المخصصة للإعطاء عن طريق الفم. تسمح هذه الطريقة بالوصول إلى السطح القمي للأمعاء. يمكن إضافة المركبات إلى وسائط الخلايا ويتم تناول المركبات بشكل قمي كما ستكون في الجسم الحي.
قد يجد الباحثون المهتمون بإنشاء نظام في المختبر لالتهاب الأمعاء لاختبار العلاجات الفموية المحتملة أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص. قد تتطلب الأنسجة التي يتم الحصول عليها من مختلف الأعمار والأنواع مزيدا من التوحيد. لذلك قد تكون هناك حاجة للمرضى أثناء تحديد أوقات عكس القطبية.
لعكس قطبية المعوية 3D شفط الوسائط من كل بئر من لوحة بئر 24 من المعوية القاعدية 3D المعمول بها. أضف 500 ميكرولتر من خمسة ملليمولات من الثلج البارد أو EDTA أو PBS إلى كل بئر من صفيحة البئر 24 وقم بتعطيل مستخلص الغشاء السفلي أو قبة المصفوفة خارج الخلية ميكانيكيا بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات باستخدام ماصة P 200. انقل محتويات أربعة آبار إلى أنبوب مؤرخ بسعة 15 ملليلتر.
ثم أضف ثمانية ملليلترات من الثلج البارد EDTA مائل PBS إلى الأنبوب. نقل ال 20 بئرا المتبقية بنفس الطريقة. احتضن الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على منصة دوارة أو شاكر عند 330 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة الطرد المركزي الأنابيب والتخلص من supernatant من كل أنبوب. الجمع بين وغسل الكريات مع خمسة ملليلتر من DMEM F12. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلايا وإزالة المادة الفائقة قبل إضافة 12 ملليلتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى الأنبوب لضمان إنعاش كريات الخلايا.
Pippet 500 ميكرولتر من التعليق المعوي في كل بئر من 24 بئر منخفضة للغاية مرفق البئر. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى خمسة أيام أو حتى تعكس الأمعاء القطبية. في اليوم الأول الممتنع عن التصويت، انقل محتويات أربعة آبار من صفيحة 24 بئرا إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر.
كرر ذلك لجميع الآبار المرغوبة مع كل علاج في أنبوب منفصل. الطرد المركزي للأنابيب وإعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من 4٪ من مثبت الألدهيد في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة اغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من PBS.
أضف 500 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X 100 إلى الأنابيب. احتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على دوار أو شاكر عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
بعد الحضانة الأخيرة ، أضف 500 ميكرولتر من 10٪ NDS في PBS T واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي. في اليوم التالي ، أضف 250 إلى 500 ميكرولتر PBS T إلى الأنابيب اعتمادا على حجم الكريات ، وضعها على الدوار أو الخلاط عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
أضف 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضن الأنابيب عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية في الظلام. في اليوم التالي ، تابع تركيب المعوية القمية الملطخة عن طريق تدوير الأنابيب وإزالة 100 ميكرولتر من supernatant. أعد تعليق الخلايا في ال 100 ميكرولتر المتبقية من supernatant وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب 500 ميكرولتر.
الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 20 ثانية. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة بقعة الحمض النووي الأحمر البعيد. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من PBS.
بعد الغسيل الثاني والطرد المركزي ، قم بإزالة 70 ميكرولتر من supernatant وإعادة تعليق الكريات في الحجم المتبقي من PBS. ثم انقل تعليق الخلية إلى زلة غطاء 24 × 60 ملم. ضع 75 ميكرولتر من الحامل مباشرة على العينة وقم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة.
بعد المعالجة الليلية في الظلام ، ضع طبقة رقيقة من الجلسرين على زلات الغطاء ، ثم قم بتركيب الغطاء على الشريحة الزجاجية واضغط عليه برفق في مكانه. انقر لإزالة أي فقاعات بين انزلاق الغطاء والشريحة. اسمح لانزلاق الغطاء بضبطه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين قبل تصوير الأمعاء عند تكبير 20 مرة باستخدام مجهر متحد البؤرة.
بالنسبة للعلاجات المعوية ، قم بإنشاء التهاب الأمعاء والقولون القمي الناخر في نموذج طبق لمدة 24 ساعة كما هو موضح في مخطوطة النص. قبل إجراء الفحص ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر تاركا ال 400 ميكرولتر المتبقية. أضف 400 ميكرولتر من كاشف فحص صلاحية الخلية إلى كل بئر.
امزج المحتويات بقوة على شاكر الطبق لمدة خمس دقائق عند 200 دورة في الدقيقة للحث على تحلل الخلايا. بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر إلى بئر واحد من 96 صفيحة ذات قاع واضح جيدا. كرر ذلك بالنسبة لل 600 ميكرولتر المتبقية مما يخلق أربعة نسخ طبق الأصل تقني لكل بئر.
باستخدام قارئ لوحات قادر على التلألؤ ، سجل القيم عند تكامل 0.25 مللي ثانية وقارن القيم النسبية بين العلاجات. أكد تلطيخ التألق المناعي التمثيلي للتحكم التوطين القمي للنوى نحو التجويف والكشف عن الشرير عند الحافة الخارجية للظهارة. بالمقارنة مع السيطرة ، فإن التعرض لعديد السكاريد الليبي ، أو نخر الورم ألفا ، أو نقص الأكسجة وحده لم يحفز تغييرات علنية في مورفولوجيا الخلايا الإجمالية E-cadherin أو توطين الشرير أو كثافة الفلورسنت.
أدى العلاج بعديد السكاريد الليبي أو نخر الورم ألفا بالاشتراك مع نقص الأكسجة إلى تعطيل البنية الظهارية وأظهر فقدانا كبيرا في تقاطع الالتصاق وتعبير البروتين الحدودي للفرشاة الذي كشف عنه فقدان السمع ECA وتلطيخ الشرير. تم تحديد صلاحية الخلية القمية في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. في ظل الظروف المعيارية مقارنة بالتحكم في عديد السكاريد ليبو أو نخر الورم ألفا لم يؤثر بشكل كبير على بقاء الخلايا المعوية.
ومع ذلك ، لوحظت انخفاضات كبيرة في الجدوى في عديد السكاريد الليبو أو نخر الورم ألفا في تركيبة مع نقص الأكسجة مقارنة بنقص الأكسجة وحده. أثناء إنشاء نموذج قمي في طبق. تذكر أن تبقي EDTA في الجليد تعليق الخلية باردا.
سيؤدي ذلك إلى تعزيز انعكاس القطبية وضمان تسييل جميع ECM وإزالتها بشكل صحيح. يمكن إجراء تطبيقات أخرى في المراحل النهائية مثل QPCR أو RNA-seq أو النشاف الغربي أو التقييمات الوظيفية لنفاذية الحاجز بشكل أكبر لتوصيف الاستجابة للإشارات الالتهابية في نقص الأكسجة.
