这是一个研究小肠如何处理不同物理性质的材料以及它如何在空间中分布这些材料的协议。它是我们研究肠道机械敏感性的补充工具。该协议的主要优点是它可用于研究具有不同物理性质的材料或混合物，并且该分辨率使我们能够解决短肠段的区域过境。
这种技术增加了我们对肠道机械敏感性的理解。它帮助我们了解小肠如何根据它从腔内内容物接收的机械线索做出运输决策。首先，通过将18号厚度和50毫米长的喂食管连接到1毫升注射器并吸取200微升RITC溶液或微球溶液来准备管胃。
接下来，使用单手约束技术手动约束禁食的动物，然后轻轻地将喂食管插入小鼠的口腔和食道，直到它进入胃部。插入后，缓慢地将注射器内容物排出胃中，并小心地从鼠标上取出管子。管饲后，将鼠标放回笼子。
在开始解剖之前，打开体内成像仪器，使其达到所需的温度。安乐死后，将鼠标置于解剖台的仰卧位置，并将其四个附属物固定在舞台上以进入腹部。接下来，用70%乙醇润湿腹部表面。
接下来，使用显微解剖钳拉扯皮肤，并使用锋利的手术剪刀在肛门上方 1 厘米处做一个横向切口。要暴露腹膜腔，请继续垂直向上腹部切口，直到肋骨。轻轻处理肠道，并在操作它们之前欣赏它们在腹腔中的方向。
切开胃食管交界处的近端，从而将胃与食道分开，并通过向相反方向缓慢拉动来轻轻解开结肠、盲肠和小肠。使用显微解剖剪刀将肠系膜与肠道的附着物分开。之后，使用镊子将解剖的肠转移到测量板上。
将胃放在0毫米处，沿着尺子排列肠道直到200毫米，然后用显微解剖剪刀将肠切开200毫米，并重复这种肠道对齐过程。一旦组织排列在尺子上，将盲肠与组织平行排列，但不要与其直接接触。将带有解剖组织的测量片放在黑暗区域，以便可以保留荧光，直到成像为止。
要开始离体成像，请打开成像软件。登录并初始化成像仪器，为图像采集做好准备。对于 RITC 管饲法，将激发设置为 535 纳米，将发射设置为 600 纳米。
而对于绿色微球珠，将激发设置为 465 纳米，将发射设置为 520 纳米。现在，将曝光设置为自动并选择视野。确保肠在运输过程中没有移动后，将测量表放入视野内的仪器中。
牢固地关闭仪器的门，然后选择快照以拍摄视野。将收集的照片保存到闪存驱动器进行分析。接下来，保存荧光和照片图像的单独捕获。
照片和荧光的叠加表示荧光物质在胃肠道中的位置。在图片编辑软件中打开荧光和照片图像文件进行分析。调整两个图像的像素大小以具有确切的尺寸并关闭照片文件。
对于荧光图像，请使用橡皮擦工具去除背景并使其透明。创建新图层。选择黑色填充到图层，然后将图层拖动到带有荧光图像的图层下方，并制作全黑背景。
将仅包含黑色背景上的荧光信号的新荧光图像另存为新的TIF文件。在 ImageJ 中打开新的荧光灯和照片图像。通过选择"图像"，然后选择"类型"和"30 位"，将每个图像转换为 30 位图像。
通过选择"图像"，然后选择"颜色"和"合并通道"来创建两者的合并图像。在打开的对话框中，选择灰色通道的照片文件和任何彩色通道下的荧光文件。关闭合并图像的比例，方法是选择"分析"，然后选择"设置比例"和"单击以移除比例"。
在 ImageJ 中选择"矩形"工具。在小肠的一部分周围画一个矩形，同时密切注意这个感兴趣区域的宽度，因为它应该在所有感兴趣区域之间保持一致。通过选择图像复制感兴趣区域，然后选择复制并仅选择与彩色通道对应的通道。
同样，使用矩形工具在整个新图像上绘制感兴趣区域，并通过选择分析，然后选择绘图配置文件来检索荧光配置文件。打开值列表并将其复制到电子表格软件。重复从绘制感兴趣区域到检索小肠每个部分的荧光图谱的步骤，如前所述在不同的标尺行上。
在电子表格软件中，将每个平均强度值乘以上一步中创建的感兴趣区域矩形的常量宽度。这将在每个点产生沿小肠的实际强度值。这里显示的是沿小肠长度的平均荧光迹线。
荧光材料的分布根据腔内内容物的材料特性而变化。增加用于对相同原始数据集进行排序的箱数，可以发现使用较少的箱无法解析的粒度跟踪特征。较小的箱子可降低测量不确定性，提高空间分辨率，并更好地反映小肠蠕动的分布成分。
几何中心无法完全表征腔内内容物的空间分布。几何中心测量的这种局限性在液体和较大珠子之间的比较中很明显。较大磁珠的荧光迹线分布更分散，但无论分档粒度如何，它的平均点都与液体相似，这突出了仅聚焦几何中心的局限性。
为了解释小肠收缩的分布性质，本研究纳入了功率谱分析。绘制功率谱表明，随着箱尺寸的缩小，我们可以观察到较大磁珠频谱中的明显主导频率，但在小磁珠频谱中则不然。这些额外的主频率中的一些（但不是全部）存在于液体频谱中。
该协议最微妙的步骤是管饲和解剖。在出于实验目的执行此技术之前，这些应由实验人员进行标准化。这是一个终端实验，因为动物需要被牺牲。
如果可能，通过在此实验之前进行其他非终末实验来最大限度地利用您的动物模型。我们小组最近使用这种技术来支持我们对肠道触摸组的发现，其中肠道使用上皮机械感受器来感知更精细的物理特性，就像我们的手指一样。
