用于细胞外囊泡分析的冻裂-断裂电子显微镜

在视频中，我们介绍了一种在体外冷冻压裂来自膀胱癌细胞的细胞外囊泡的方案。细胞外囊泡是膜受限囊泡，来源于细胞释放到细胞外空间并在细胞间通讯中起作用。在细胞外囊泡中，我们区分了三个群体，外泌体，微泡泡和凋亡体，它们的起源，大小和分子组成各不相同。

细胞外囊泡的分子组成反映了供体细胞的分子谱并干扰受体细胞中的生物过程。然而，细胞囊泡限制膜的组成对于与受体细胞膜的相互作用至关重要。为了分析限制膜的组织，必须首先分离细胞外囊泡，然后接近冷冻断裂技术。

冷冻断裂是一种电子显微镜技术，专门用于研究生物膜（包括囊泡）的二维组织。冷冻-压裂的步骤是快速冷冻试样，压裂试样，制作冻裂断裂表面的复制品，清洗复制品以去除生物材料。复制品最终用透射电子显微镜可视化。

我们的目标是使用冷冻断裂技术从形状，大小和膜组成的角度表征微囊泡。从细胞培养箱中的细胞生长开始。在显微镜下检查细胞以确认其变异性和汇合度。

将带有微囊泡的培养基收集到管中，并以300g力离心10分钟。收集上清液。随后，在2000 g力和10， 000 g力下离心上清液。

之后，观察管的尖端是否有指示微囊泡的白色颗粒。小心地除去上清液。加入1.5毫升PBS，并重新悬浮含有微囊泡的颗粒。

然后以10， 000 g力离心。观察白色颗粒。取出上清液，轻轻加入固定剂。

在 4 摄氏度下静置 20 分钟。接下来，取出固定剂，并加入洗涤缓冲液冲洗沉淀而不重新悬浮。在 4 摄氏度下静置 10 分钟。

除去洗涤缓冲液，加入30%甘油至沉淀。将沉淀重新悬浮成均匀的悬浮液，并在4摄氏度下孵育30分钟。准备带有中心凹坑的清洁铜载体，并开发带有皱眉和液氮的烧瓶。

在显微镜下，将样品转移到铜载体的中心坑中。混合凝固的氟利昂变成液化。用镊子抓住载体的外圈，并将其浸入冷却的氟利昂中。

八秒钟后，迅速将载体转移到装有液氮的显影瓶中。马克哭泣和冷却它。在液氮下将载体收集到病毒中，将其关闭，并储存在液氮容器中直至冻结破裂。

根据制造商的操作说明准备冷冻分数单位。启动真空系统并将单元室冷却至零下150摄氏度。将带有冷冻样品的铜载体转移到冷冻分馏装置中。

将刀温设置为零下100摄氏度，等待真空。通过打开刀具的电动运动开始切片样品，直到样品表面光滑。对于压裂，请关闭刀具的电动运动，并继续缓慢手动控制刀具。

继续以45度角进行铂金阴影。打开高压并增加铂金枪的电流。铂金的火花应该开始遮蔽样品。

监督铂在石英晶体厚度监视器上的位置。铂金的推荐厚度为2.5纳米。关闭电流和高张力。

以90度角继续进行碳阴影。打开高压并增加碳枪的电流。碳的火花应该开始遮蔽样品。

当获得2.5纳米的碳时，关闭电流和高张力。将这些带有复制品的样品从冷冻压裂装置转移到装有双蒸馏水的12阀板中。复制品将漂浮在水面上，而载体下沉。

将带有钢丝环的复制品转移到充满次氯酸钠的12阀板中，并孵育过夜。在双蒸馏水中清洗复制品。将它们收集在网状铜TM炉排上，并让它们在空气中干燥两个小时。

使用透射电子显微镜对复制品进行成像并获得显微照片。为了准确解释复制品和显微照片，请遵循正确命名方向的指南。对复制品的分析表明，分离的条件培养基含有富集的囊泡部分。

孤立的囊泡要么聚集在三个或更多个簇中，要么非常单独分布。囊泡呈球形。囊泡的直径对应于微囊泡的直径。

冷冻压裂也揭示了微囊泡膜的二维组织。微泡的外质相具有光滑，均匀的外观，而在原生质体阶段，我们观察到膜间颗粒。膜间颗粒零星出现，这意味着从癌物质细胞中分离出的微囊泡仅含有少量的膜蛋白或蛋白质组装体。

总而言之，所提出的方案中使用的冷冻骨折技术被证明是表征细胞外囊泡的最佳技术，可用于评估其他细胞外囊泡群体。冷冻骨折技术的一个关键优点是它能够解决囊泡限制膜的内部组织，这决定了细胞外囊泡的生物学功能。