该协议采用超分辨率显微镜，特别是直接随机光学重建显微镜，也称为dSTORM，以绕过衍射极限，并在三维空间中以纳米精度可视化EV。dSTORM的一个显着优点是它能够直接可视化光衍射水平下的粒子，而不会破坏改变EV生化性质的步骤。许多进化上不同的病毒采用EV信号传导，因此，dSTORM可用于表征EV的疾病生物标志物和进展，以及可视化单个病毒颗粒，如SARS-CoV2。首先将亲和纯化的细胞外囊泡或EV置于玻璃底，微滑梯，八孔板上，总体积为200微升，并让它们在4摄氏度下粘附在表面上过夜。
在不从八孔板中取出现有溶液的情况下，通过将200微升4%多聚甲醛在1X PBS中加入到每个孔中含有EV的溶液中，将EV固定在板上，并允许板在室温下孵育30分钟。用微量移液器小心地去除多聚甲醛和多余的溶液，以免打扰电动汽车。用1X PBS清洗EV以除去多余的多聚甲醛。
执行洗涤程序三次。取出多余的 1 倍 PBS。根据制造商的协议，通过在成像缓冲液中稀释的五毫摩尔原儿茶素双加氧酶溶液，为每个样品制备250微升dSTORM Bcubed缓冲液溶液。
根据制造商的方案，向每个孔中加入250微升制备的缓冲液，并在成像前在室温下孵育板20分钟以清除氧化分子。电动汽车可以立即可视化或在四摄氏度下储存一周。为了制备超分辨率显微镜校准所需的微珠，将100纳米微球稀释至分子生物学级水中浓度为0.5%，并将200微升移液到玻璃底，微滑梯，八孔板的每个孔中。
让珠子在室温下在孔中沉降一小时。在不去除现有溶液的情况下，向校准珠溶液中每个孔中加入200微升PBS中的4%多聚甲醛，并在室温下孵育30分钟。用微量移液管小心地除去多聚甲醛，以免干扰珠子，并用1X PBS洗涤珠子三次。
按照手稿中的描述准备缓冲区。除去1X PBS并向每个孔中加入250微升制备的缓冲液。在可视化之前，让缓冲区静置 20 分钟。
使用"连接显微镜"按钮连接到3D显微镜，然后再将任何东西放在载物台上。向物镜中加入100X油，并将井的中心放在物镜的顶部。在"采集"设置中，打开 473 纳米和 640 纳米激发激光器，然后单击"查看"。
在不激活3D镜头的情况下，通过单击"图像显示选项"中的光子计数，在光子饱和度设置下查看磁珠。对于 473 纳米激光器，将初始激光功率设置为 8.4 毫瓦，对于 640 纳米激光器，将初始激光功率设置为 11.6 毫瓦。将激光的焦点减小到零下300纳米左右或校准微球的焦平面，以产生单个微球的清晰分辨率。
Z平面聚焦后，进一步调整激光功率水平，以考虑每个视场的变化。在仪器功能下，完成3D映射校准和通道映射校准，以获得X，Y和Z轴上的误差。在通道映射校准期间，将最大视场数设置为 20，将目标点数设置为 4， 000，将通道之间的最大距离设置为 5.0 像素，将通道之间的排除半径设置为 10.0 像素。
确保校准产生的点覆盖率大于90%，并且映射质量良好。保存给定的校准数据，以备将来图像采集。在物镜上加入100X油，然后将准备好的EV放在显微镜上。
在不激活3D镜头的情况下，打开640纳米激发激光器，最初将其提高到1.2至12.5毫瓦之间，具体取决于视场中信号的强度，以激发红色膜，插层，染料染色的EV。在"图像显示选项"下，将查看方法从光子饱和度切换到百分位数，以更好地可视化EV。调整激光功率以最小化噪声，同时最大化信号并保持所有其他参数。
通过单击 Z 轴上的向上或向下图标来调整 Z 平面的焦点。将曝光时间设置为20毫秒，帧捕获设置为10， 000帧，初始激光功率设置为1.2至12.5毫瓦之间，具体取决于信号强度和视场。使用图标激活3D镜头，然后单击"获取"按钮开始采集。
在整个图像采集过程中，将激光功率提高三次，每1000帧提高10次，或足以保持高信噪比。在采集过程中不要调整 Z 平面。图像采集后，切换到"分析"查看窗口。
对未过滤的图像执行漂移校正，然后激活滤镜。调整光子计数、定位精度、西格玛和帧索引，如手稿中所述。从视野中沿单个 EV 的 X 轴覆盖 X、Y、Z 平面视图工具，并导出照片切换事件的各个 csv 文件。
使用直线直方图工具将X，Y轴上的单个EV一分为X，Y视场，该工具将照片切换事件固定到设置的距离组中。拍摄单个电动汽车的图像并将其另存为tif文件。使用3D可视化工具创建单个EV的3D视频，并根据沿Z轴的位置进行颜色。
在对在X，Y轴上产生16纳米和Z轴上产生38纳米平均误差的显微镜进行校准后，纯化的u20s EV在X，Y轴上以高达20纳米的分辨率和沿Z轴的50纳米成功可视化。在3D照片中通过dSTORM可视化的单个EV随着激光功率的增加而在整个10， 000帧曝光期间切换，并且在获得的图像中显而易见。Z平面的采集后图像校正，光子计数，西格玛和重建图像的定位精度使EV在3D中具有清晰的分辨率。
EV照片仅在前7， 000帧期间切换，如右上角的图例所示。直方图证实大多数光电开关事件发生在100纳米半径内，验证了可视化的EV是外泌体，并且小直径EV的分离是成功的。使用线直方图工具和X，Y，Z平面视图工具对其他单独跟踪的EV进行尺寸分布分析，确认大多数光开关事件发生在中心半径100纳米范围内。
沿Z轴的误差增加，沿轴轴产生EV的细长最终图像。光开关事件与EV大小无关，这表明基于dSTORM的表征可用于小型EV，如外泌体和直径小于100纳米的小型包膜病毒。在执行dSTORM时，重要的是要记住将初始激光功率设置得非常低，并在整个图像采集过程中缓慢提高它，以防止光漂白。
自开发以来，dSTORM使研究人员能够更好地了解亚细胞结构的形态，这些结构以前由于典型光学显微镜的衍射极限而无法可视化。
