胎儿和成体神经干细胞衍生少突胶质细胞前体细胞培养物的高内涵筛选分化与成熟分析

该协议结合了神经干细胞衍生的自发混合培养物的年龄特异性分离，其中含有分化的少突胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞，模拟病理条件的测定以及稳健的高内涵读数。这些特征使得在生理和病理条件下以及在考虑星形胶质细胞贡献的微环境中对发育性髓鞘形成和成人髓鞘再生进行差异研究成为可能。对于从胚胎第13.5天到14.5胎儿前脑的神经干细胞分离，将胚胎的头部放在带有冰冷PBS的干净培养皿中，并使用镊子在放大镜下从颅骨上取出皮肤。

一旦大脑可见并清除皮肤，使用镊子将大脑挤出颅骨并去除小脑。使用镊子除去脑膜并将分离的组织置于非酶解解缓冲液中。当所有脑组织被分离出来后，每1.5毫升管在150微升的非酶解解缓冲液中拉出两到三个样品，并在37摄氏度下连续振荡孵育管15分钟。

在孵育结束时，向每个管中加入850微升标准培养基并移液混合，直到悬浮液没有团块。如果仍然可见未解离的组织，则让样品静置两分钟，以使组织沉降到管的底部。当解离完成时，在T25或T45烧瓶中以每微升10至50个细胞的密度将细胞置于10至30毫升的神经球培养基浓度中，并将烧瓶置于细胞培养箱中的垂直位置以防止细胞附着。

从2.5个月大的成年小鼠，将4至5只成年小鼠的大脑放入50毫升冰冷的HBSS管中，并将一个大脑腹侧朝下，朝向喙尾方向放在无菌铝箔覆盖的烧瓶上，该烧瓶装满了零下20摄氏度的过夜冷水。使用剃须刀片去除嗅球，并从皮层到光学视交叉切割两到三个一毫米厚的冠状切片。将切片放在腹背位置的冷表面上，并识别胼胝体和两个侧心室。

使用放大倍率分离侧脑室壁，注意不要包括胼胝体的碎片，并将分离的组织置于5至10毫升酶解解缓冲液中，在37摄氏度下孵育15分钟。在孵育结束时，移液组织至少50次，然后将样品在37摄氏度下孵育10分钟。在孵育结束时，用5毫升标准培养基中和胰蛋白酶，并通过70微米过滤器过滤组织悬浮液。

将过滤后的溶液以400次g离心五分钟，然后将沉淀重新悬浮在蔗糖溶液中进行第二次离心。在离心结束时，将沉淀重新悬浮在牛血清白蛋白洗涤溶液中进行另一次离心，然后将沉淀重新悬浮在标准培养基中进行计数并将细胞接种在直立的T-25或T-45烧瓶中。对于原发性神经球分化，每两天在神经干细胞培养物中加入碱性成纤维细胞和内皮生长因子。

当神经球达到100至500微米直径时，根据标准方案通过机械解离使细胞通过。对于寡球分化，每两天用血小板衍生因子-AA中的碱性成纤维细胞生长因子处理细胞。当寡球达到100至150微米直径时，根据标准方案通过机械解离解解球体，并将细胞悬浮液以每平方厘米3000细胞密度接种到聚DL-鸟氨酸层粘连蛋白包被的板上。

三天后，用相同体积的少突胶质细胞分化培养基替换每种培养物的上清液。为了进行炎症介导的分化阻断诱导，在神经球解离后和寡球层产生期间，将感兴趣的细胞因子混合物加入培养基中。为了诱导缺氧 - 葡萄糖细胞死亡，在接种到多孔板两天后，将上清液从每种培养物转移到多孔板的单个孔中。

向孔中加入一半体积的OGD培养基，并将培养物转移到充满95%氮和5%二氧化碳的气密缺氧室中。将培养箱置于细胞培养箱中。三小时后，用从多孔培养板中留出的培养基替换腔室中的培养基。

检查细胞染色质量后，在高内涵筛选软件的"采集"菜单中，选择"固定曝光时间"和"迷你扫描"，然后选择每孔10个场，每个实验条件选择两个孔，以便为整个板设置场子集中的分析参数。按照工作流程逐步开发整个算法。选择"处理每个通道的图像"，然后单击"背景删除"以选择所需的信号电平。

要通过核染色识别和选择原子核，请单击识别主对象，调整阈值以识别单个原子核，然后单击验证主对象以根据对象区域和位置设置阈值。单击识别对应于特定谱系标记的每个通道的斑点，并将环值宽度设置为三，距离设置为零，以允许识别细胞质荧光。在工作流程中选择参考水平以构建分析，并允许根据核大小和核染色强度自动计数凝聚的细胞核，并根据环鉴定的细胞质荧光自动计数特定的标记阳性细胞，然后单击播放。

在培养的第一阶段，神经干细胞维持其巢蛋白表达。大多数细胞也是NG2阳性的。对应于少突突前胶质细胞阶段的 CNPase 阳性细胞在 T3 介导的分化诱导后 3 至 6 天可检测到，而成熟的 MBP 阳性少突胶质细胞在体外 6 至 12 天后出现显著百分比。

高内涵筛选分析允许通过核染色和荧光强度分析检测培养物中的单个细胞。分化阶段结束时培养物的组成根据培养物是胎儿起源还是成人起源而有所不同，胎儿培养物对T3介导的分化反应更强，并且达到更高百分比的成熟少突胶质细胞。请注意，当神经干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞以高密度接种时，它们聚集，复制星形胶质细胞迅速产生汇合细胞层，从而阻止观察成熟少突胶质细胞的特征蜘蛛网形状。

炎症介导的分化阻断诱导成熟前少突胶质细胞的强烈减少，如胎儿和成人培养物中的CNP酶和MBP染色所检测到的那样。少突胶质细胞前体细胞数量的增加也发生在细胞因子处理的成人培养物中。虽然胎儿和成人少突胶质细胞前体细胞对炎性细胞因子暴露表现出相同的结果，但只有胎儿来源的培养物对缺氧葡萄糖的毒性敏感。

该方法可以与任何类型的少突胶质细胞前体细胞一起实施，分化和成熟干扰过程，以测试旨在对抗影响髓鞘形成或髓鞘再生的疾病的新策略