用于神经元细胞贩运研究的管子中纯化和直接单生物素重组BDNF的改进协议

该程序的总体目标是在涉及 HEK293 细胞转染和色谱柱纯化的优化协议中生产和纯化 BDNF 2 管。然后，BDNF oviduct 通过体外反应进行单生物素化，用于后标记和荧光显微镜检测。该程序的主要优点是，它允许BDNF的生产、纯化和单生物基化得到优化。

妊娠参数已针对使用经济高效的转染试剂进行最大 BDNF 生产进行了优化，纯化过程在色谱设置中执行，便于操作，并允许升级过程。首先稀释60微克聚乙胺胺在500微升未升制的DMEM和20微克的BDNF卵巢质粒在500微升未升DMEM每15厘米的培养物进行转染。在室温下孵育五分钟，然后小心地将DNA溶液移液到聚乙二烯胺管中，通过上下运动混合一次。

在室温下孵育25分钟，然后在每个15厘米的培养皿中滴一毫升PEI/DNA混合物。用PEI/DNA混合物孵育细胞三小时，然后将介质更改为孵育缓冲液。细胞转染48小时后，从所有菜肴中收集介质。

然后将BDNF介质成分加入 HEK293 中上流液，包括氯化钠、磷酸盐缓冲成分、伊米达佐尔和蛋白酶抑制剂。在冰中孵育15分钟。然后将介质等到离心管中。

在4摄氏度的黄金离心机中，在10，000克的离心机中进行45分钟的离心机。此步骤允许消除悬浮在介质中的细胞碎片和死细胞。然后收集超自然。

在0.1%的最终浓度下添加BSA，在零下20摄氏度下储存长达两个月。要净化BDNF，首先在37摄氏度的热调节浴中解冻介质。然后将介质等到离心管中。

在4摄氏度的金色离心机中，在3，500克的离心机中离心机1小时。此步骤允许清除剩余的碎屑，以确保通过色谱柱的足够流量。然后使用蛋白质浓缩器将介质从500毫升减至100毫升。

按照制造商推荐的离心参数进行最佳浓度。然后将500微升镍-NTA阿加罗斯珠添加到浓缩介质中，并在4摄氏度的摇杆中孵育过夜。第二天，组装色谱仪，将介质倒入。

让它休息五分钟，然后打开双向停止公鸡，让介质流过。用五毫升的洗涤缓冲液洗涤五分钟，确保重新暂停柱中的珠子。重复三次。

最后，向列中添加一毫升洗脱缓冲液，确保重新发送珠子。孵育15分钟，然后在微离心管中收集吸水器。重复此步骤三次，以完成 BDNF 的洗脱。

要生物素化BDNF，采取含有800南克蛋白质的等分，加入生物素化缓冲试剂，然后一些BirA-GST在BDNF的一对一摩尔关系。在30摄氏度的杂交烤箱中孵育60分钟，每15分钟通过反转混合一次管子中的内容。然后添加与第一步相同的ATP和BirA-GST体积，孵育60分钟，每15分钟混合一次管子的内容。

然后，生物素化BDNF可以留在冰中进行即时生物基化验证，或储存在零下80摄氏度的后分析。要验证BDNF oviduct的生物素化，首先在阻尼缓冲液中阻断每个BDNF样品的30微升链球蛋白磁珠。在室温下孵育一小时，然后在磁架分离器中沉淀磁珠，然后丢弃阻塞缓冲器。

向珠子中加入 50 微升新鲜阻尼缓冲液和 BDNF 样品，确保完全重新暂停。在微离心管旋转器中，在四摄氏度下对管内物进行均质化，孵育一小时。准备样品进行西印，如本文所述，以评估生物杀菌反应的效率。

要将BDNF oviduct与量子点结合，首先添加必要的量子点体积，以实现与BDNF的一对一摩尔关系，然后稀释到20微升的最终体积。使管子中的内容均匀化，然后用铝箔包裹，以保护其免受光线的光。在室温下在摇杆中孵育30分钟。

然后将BDNF 卵巢稀释到所需的最终浓度，并将其添加到微流体室的斧头室中，孵育210分钟，用于后活细胞或固定细胞成像。使用基于色谱柱的协议可以处理大量 HEK293 条件介质。在这个实验中，对500毫升的调节介质进行了处理，以净化BDNF 20。

连续四次洗脱，每次持续15分钟，使BDNF 200的浓度降低，从每微升6微克到28纳米。BDNF卵巢的总产量约为60微克。这种纯化的BDNF随后由Bira-GST的体外反应进行生物素化。

该样品是均匀的生物素化，如磁珠清除缓冲液的上清剂中缺乏非生物基化BDNF ovi。这些结果表明，该方案允许纯化大量的BDNF异管和异质体外单生物基化。然后用两种不同的实验方法对单生物基化BDNF的生物活性进行了评价。

首先，在60毫米板中播种的皮质神经元被刺激，每毫升单生物基化BDNF50毫微克30分钟，然后蛋白质被准备用于西部印迹分析。通过检测磷-TrkB和磷-ERK，对单生物素化BDNF的生物活性进行量化。BDNF 与 TrkB 的结合触发受体的自动磷酸化和激活多个下游激酶，包括 ERK。

包括了BDNF未刺激的负控制条件和用市售BDNF刺激的正对照条件，用于BDNF卵巢生物活性的分析。这些频段都是磷酸化蛋白，在用商用BDNF和单生物基化BDNF治疗的神经元中具有相似的强度，并且都显示出比负控制条件更强的信号。然后对单生物基化BDNF与链球菌量子点耦合的生物活性进行了评价，证明它们可用于实时成像实验。

皮质神经元在10毫米的覆盖物中播种，最后浓度为200皮摩尔或两个纳米摩尔BDNF量子点30分钟，然后固定和染色磷-CREB。CREB 是皮质神经元中激活的 ERK12 所针对的转录因子。刺激BDNF量子点浓度增加的神经元导致CREB的磷酸化剂量增加，量子点粒子在核周围存在，表明BDNF量子点粒子被内分泌，并触发与BDNF-中导TrkB激活相关的信号通路的激活。

使用200个象形蛋白BDNF量子点刺激神经元时检测到磷-CREB信号增加两倍，而用两个纳米摩尔BDNF量子点刺激时，磷-CREB信号增加3.5倍。因此，生物基化BDNF输卵管具有生物学活性，与链球菌量子点耦合时不会失去活性，因此适合免疫荧光和活细胞成像。最后，利用微流体室对BDNF量子点的成像潜力进行了分室评价。

皮质神经元在微流体腔室中播种，分离突触和躯干室，用两个纳米摩尔BDNF量子点刺激3.5小时。进行了活细胞显微镜，并采用生成的 kymograph 来量化含有细胞器的 BDNF 量子点的速度。检测到的平均移动速度为0.91微米/秒，这与以往对细胞质胸矿介质传输的分析一样。

使用两个纳米摩尔链球菌量子点处理的微流体腔室没有像 kymgraph 所示在微组中显示移动的量子点。在相同条件下生长的细胞用500个象形体或两个纳米摩尔BDNF量子点刺激210分钟，然后用核污渍固定并标记。使用BDNF量子点治疗的神经元显示所有分析子部门（包括微组和索马登德里蒂室的近位和近部部分）中标记蛋白的剂量依赖性积累。

相比之下，控制神经元在整个腔室中几乎没有显示量子点信号。因此，BDNF量子点可以在微流体室的活细胞和固定细胞中检测。观看此视频后，您应该对如何在基于色谱柱的成本效益程序中生产单生物基化 BDNF 12 电道有一个很好的了解。