使用基因组-规模CRISPR/Cas9基因屏幕进行细胞表面受体识别

使用现有生化方法检测细胞表面相互作用仍然构成技术挑战。该协议提供了一个遗传替代方案，利用基因组规模细胞筛选方法，以确定细胞表面的受体配体相互作用。与大多数其他现有方法不同，这种方法对受体的生物学没有假设。

它提供了机会来识别由各种细胞表面分子培养的相互作用。细胞表面分子可直接被单克隆抗体等药物访问。因此，识别这些分子所调解的相互作用可以具有重要的治疗意义。

这种方法一般适用于有兴趣探索细胞信号和识别过程的研究人员，其生物背景广泛，包括神经和免疫相互作用以及宿主病原体相互作用。该协议需要高通量的细胞分拣机和下一代测序机。在启动协议之前，请确保这些设施可用。

首先在96井板中对生物素化蛋白质样品进行8次连续稀释，确保每次稀释的最终体积至少为200微升，并包括标签控制。从每一个井中去除 100 微升，并将其转移到新的 96 井板中，从而制作样品的重复板。包括一个仅标签的蛋白质控制，将用作控制探针的所有结合文章。

将100微升（每毫升0.1微克）的链球菌-PE添加到其中一个板中的井中，向另一个板的孔中加入100微升稀释缓冲液。在室温下孵育板20分钟。同时，用稀释缓冲液阻断斯特普他丁编码板的孔15分钟。

洗完盘子后，确保盘子干燥。然后将样品的总量从两个板转移到铁丁编码板的单个孔中，并在室温下孵育一小时。孵育后，用200微升的洗涤缓冲液洗三次。

加入100微升的小鼠抗鼠Cd4d3+4IgG，再孵育一小时。重复洗涤。加入100微升的抗小鼠碱性磷酸酶结合，并在室温下离开板一小时。

然后用洗涤缓冲液洗井三次，用稀释缓冲液洗一次。在染料乙醇胺缓冲液中，以每毫升一毫克的速度准备磷酸丙基苯，并在每井中加入100微升。经过15分钟的孵育，测量吸光度有每个井在405纳米。

使用板上没有信号的最小稀释系数作为适当的稀释因子来创建三角板。在室温下孵育链球菌素-PE和适当的生物素化蛋白稀释30分钟。然后在四摄氏度的光保护管中储存结合蛋白，直到进一步使用。

用经过处理和控制样品旋转锥形管，在200次G下旋转5分钟。取出上流液，将其中一根管子冷冻在零下20摄氏度，供以后使用。用 1%BSA 将另一管中的颗粒重新悬浮在 10 毫升 PBS 中，并留出 100 微升细胞作为 96 井板的负对量。

然后将预结合重组蛋白加入锥形管和96孔板中的细胞悬浮液。在台式转子上，以温和旋转的四摄氏度进行至少一小时的细胞染色。然后在200次G下对细胞进行5分钟的颗粒化，然后取出上一液。

洗涤细胞两次后，在PBS的五毫升中重新悬浮。通过 30 微米应变器对细胞进行应变，以去除细胞簇。然后用流索多分析它们。

使用阴性控制样本为 BFP 阳性和 PE 阴性细胞提供门。然后对样品进行排序，将50万至100万BFP阳性和PE阴性细胞收集到1.5毫升离心管中。疼痛笼将取决于细胞与蛋白质的结合，但通常收集一到5%的PE阴性样本。

现在让排序的细胞通过离心500次G五分钟，然后小心地去除上清液。颗粒可以在零下20摄氏度下储存长达6个月。使用 magic 的计数函数将序列从未排序和排序的群体映射到参考库，这将生成原始计数文件。

使用未排序控制样本的原始计数作为控件，使用已排序样本的计数作为处理，运行 magic 的测试函数。打开生成的基因摘要文件，按升序对暂停排名列进行排名。然后识别错误发现率小于点 0.05 的命中。

受体通常排在第一位。最后使用 R 或等效软件绘制稳健的排名算法分数以进行正选择。在NCI-SNU-1和HC-293细胞中分别进行了基因组刻度敲除筛选，用于识别人类TNFSF9和P恶性疟原虫或H5的结合伙伴。

Rh5的结合行为受硫酸肝和已知受体BSG的影响，而TN-FRSF-9没有失去与已知受体TN-FSF-9的结合。使用可溶性肝素进行预孵化。控制突变库中的GNA分布表明，在整个实验过程中，库的复杂性得到保持。

通过检查G-RNA目标非必需基因参考集的观测折叠变化的分布情况，与一组基本基因的参考分布相比，评估了屏幕的技术质量。此外，途径水平丰富表明，在辍学人口中，预期的基本途径已经确定并显著丰富。将控制样本与原始质粒库进行比较时。

强号排名算法或 RRA 得分提供了 G-RNA 的等级一直高于预期的度量。在 TNFRSF9 的屏幕中，点击时间最大的是 TNFSF9，它是已知的绑定伙伴。此外，还确定了一些与TP53通路相关的基因。

在RH5的情况下，除了已知的受体，以及生产硫酸盐的咽喉所需的基因，SLC16A1基因也被识别。筛选方法通常非常稳健，直接相互作用的受体应按此种群顺序在富集的基因列表中高排名。验证从屏幕获得的点击率至关重要。

例如，如果相互作用是由蛋白质调解的，那么旨在研究二元蛋白相互作用的生化方法可用于进一步的验证研究。由于这种方法的基因组规模性质不偏不倚，我们预计它将有助于探索难以研究细胞分子（如脂质、多通膜蛋白和甘油）的相互作用。它还可能揭示受体贩运和生物学所需的新途径。