用于基因表达分析的小鼠胚胎软骨和骨骼的激光捕获微分

骨骼结构的异质性是研究软骨和骨骼发育中基因表达的一个障碍。该协议提供了一种精确隔离相邻但不同组织的方法。我们利用紫红色染色优化软骨和骨骼的激光捕获微切除，通过保持高RNA完整性进行后续分析，使这些组织可视化，进行精确采集。

如果紫光对目标组织提供充分的区别，并且我们的处理方法后RNA质量仍然很高，则其他组织可以分离。这些组织包括颅面缝合线和大脑。冷冻是此协议中最苛刻的技能。

确保组织被快速解剖和嵌入，以保持RNA的最高完整性。要开始这个程序，解剖感兴趣的胚胎或组织。将样品嵌入一次性嵌入模具中，使用最佳切削温度化合物，用尖端或针头调整试样的方向。

在干冰和甲基-2-苯浴中快速冷冻样品。接下来，在干冰上放置一片铝箔，以制备带干冰的带盖的容器，在冷冻过程中临时存放解剖样品滑梯。将新鲜冷冻试样转移到干冰桶中。

将一层最佳切削温度化合物放在低温热试样支架上，并立即将试样放在具有温和压力的最佳切削温度化合物的顶部。当最佳切削温度化合物完全冻结时，将带试样的支架固定到低温恒温切割臂中。将样品留在低温恒温器中 15 分钟，以与切割温度平衡。

然后，将组织切成12微米的厚度，并在笔膜幻灯片上收集切片。对齐膜上的连续部分。幻灯片完成后，让部分干燥几分钟，然后将幻灯片转移到干冰容器中的铝箔上，直到收集所有所需的幻灯片。

将幻灯片存放在零下 80 摄氏度的幻灯片盒中。首先，准备三个标有15毫升的离心管。在每个管中加入45毫升80%乙醇。

把三根管子放在冰上。将含有 45 毫升 95% 乙醇的管子和含有 100% 乙醇的管子放在冰上。接下来，在室温下将45毫升二甲苯加入50毫升离心管。

将 PEN 膜滑过一个带手套的手，将 PEN 膜短暂解冻，并在每个含有 80% 乙醇的管子中清洗两次 30 秒，并搅拌以去除最佳切割温度化合物。然后，将幻灯片放在铝箔片上。8毫升1%的紫光和50%乙醇的移液器在幻灯片上染色30秒。

将含有 80% 乙醇的第三管中的幻灯片清洗 30 秒。通过含有95%乙醇的管子脱水30秒，含有100%乙醇的管子30秒，最后，含有二甲苯的管子30秒。在此之后，将幻灯片放在一个精致的任务雨刷器上五分钟，让二甲苯排出，让部分干燥。

首先，打开激光捕获显微扫描显微镜、激光和计算机。登录到计算机并启动软件。当绿灯亮时，按红色按钮激活激光。

当指示灯变红时，激光即可使用。将 5 毫升 PCR 管的盖子插入收集器中。将 50 微升的抽液缓冲器放入盖中，并将收集装置插入显微镜中。

在更改收集器设备窗口中，单击移动到参考点按钮将收集器移动到参考点。调整焦点以清晰查看参考点。接下来，单击工具栏中的左侧卸载按钮以降低幻灯片架。

将幻灯片放入支架中，组织部分朝下，然后将支架插入舞台。单击"更改试样"窗口中的"继续"。要设置激光参数，请选择激光菜单的控制选项或单击激光图标。

根据需要调整以下参数，功率，即激光的功率，光圈，即激光的宽度，速度，这是绘制和切割模式下的切割速度。从 5 倍目标开始查找感兴趣的区域，然后切换到最好显示感兴趣区域的目标。通过单击收集器上的标记选择收集管，然后选择移动和剪切或绘制和切割。

一旦切割完成，带 PEN 膜的目标组织将按重力落入收集管的盖子。重复此选择和切割过程，以根据需要拉取多个感兴趣区域。在此之后，卸载收集器并小心地关闭 PCR 管。

将微脱湿组织放在干冰上。在室温下解冻微分离组织，然后短暂离心，在42摄氏度下孵育样品30分钟。在此之后，将裂解缓冲液向下旋转到 5 毫升 PCR 管中。

按照制造商的说明，使用RNA隔离试剂盒进行DNase处理和RNA提取。在这项研究中，对软骨和骨骼进行了优化的激光捕获微分，突出了在快速程序中使用克西紫罗兰染色，以可视化软骨和骨骼进行精确组织采集，同时保持高RNA完整性，以便随后进行分析。观察幻灯片表明，所有检查的软骨都是染色品红色，所有矿化组织都是彩色或黑色。

软骨和骨骼很容易与其他组织在多个解剖位点区分。梅克尔的软骨、圆骨软骨和毛骨区通过激光采集微切除来选择和分离。为了获得足够的RNA进行测序，将梅克尔软骨的10个区域、10个圆膜软骨区域或4个毛骨区域分别拉入3个单独收集管中。

然后提取RNA，并使用生物分析器分析总RNA。这种激光捕获微切除方案用于不同发育阶段的各种组织，RNA完整性数测量表明RNA质量很高。然后进行差分基因表达分析。

有4006个基因明显和不同表达之间的骨质和梅克尔的软骨。雌细胞或骨细胞特异性基因在骨质骨中表达得更强烈，而软骨细胞特异性基因在梅克尔的软骨中表达得更强烈。此外，骨质标记在骨质骨中表达得更强烈，表明目标组织成功分离。

按照这个程序，可以进行基因表达分析，包括qPCR和RNA-seq。这些方法可以分析转录组在异质组织中特定组织或感兴趣区域的基因表达。