عدم تجانس الهياكل العظمية هو عقبة واحدة في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضاريف والعظام. يوفر هذا البروتوكول طريقة للعزل الدقيق للأنسجة المجاورة ولكن مختلفة. نحن تحسين التقاط الليزر microdissection للغضاريف والعظام باستخدام البقع البنفسجية كريسيل لتصور هذه الأنسجة لجمع دقيق من خلال الحفاظ على سلامة RNA عالية للتحليل اللاحق.
يمكن عزل الأنسجة الأخرى إذا توفر بنفسجي الكريسيل تمييزًا كافيًا للأنسجة المستهدفة وتظل جودة الحمض النووي الريبي عالية بعد طريقة المعالجة لدينا. وتشمل هذه الأنسجة الغرز القحفية و الدماغ. التكرير هو المهارة الأكثر تطلبا في هذا البروتوكول.
تأكد من أن الأنسجة هي تشريح وجزءا لا يتجزأ بسرعة للحفاظ على أعلى سلامة من الجيش الملكي النيبالي. لبدء هذا الإجراء، تشريح الجنين أو الأنسجة ذات الاهتمام. تضمين العينة في قالب التضمين المتاح مع مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، وضبط اتجاه العينة مع طرف أو إبرة.
تجميد العينات بسرعة في الجليد الجاف و الميثيل-2-حمام بوتين. المقبل، وإعداد حاوية مغطّى مع الثلج الجاف عن طريق وضع ورقة من رقائق الألومنيوم على الجليد الجاف لتخزين مؤقت من الشرائح عينة تشريح أثناء التبريد. نقل العينة المجمدة الطازجة في دلو من الجليد الجاف.
ضع طبقة من مركبات درجة حرارة القطع المثلى على حامل عينة التبريد، وعلى الفور ضع العينة فوق مركب درجة حرارة القطع الأمثل مع ضغط لطيف. عندما يتم تجميد مجمع درجة حرارة القطع الأمثل تماما، وربط حامل مع العينة في ذراع قطع التبريد. اترك العينة في التبريد لمدة 15 دقيقة لتكريرها إلى درجة حرارة القطع.
ثم، قسم الأنسجة بسمك 12 ميكرومتر وجمع الشرائح على الشرائح غشاء القلم. محاذاة أقسام متتالية على الغشاء. بمجرد اكتمال الشريحة، والسماح المقاطع لتجف لبضع دقائق، ومن ثم نقل الشريحة على احباط في حاوية الجليد الجاف حتى يتم جمع جميع الشرائح المطلوبة.
تخزين الشرائح في ناقص 80 درجة مئوية في مربع شريحة. للبدء، إعداد ثلاثة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر المسمى. إضافة 45 ملليلتر من 80٪ الإيثانول إلى كل أنبوب.
ضع ثلاثة أنابيب على الجليد. وضع أنبوب يحتوي على 45 ملليلتر من 95٪ الإيثانول وأنبوب يحتوي على 100٪ الإيثانول على الجليد. بعد ذلك، أضف 45 ملليلتر من الزيلين إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة.
ذوبان شريحة غشاء القلم لفترة وجيزة عن طريق وضعه ضد اليد قفاز، وغسلها مرتين لمدة 30 ثانية في كل من الأنابيب التي تحتوي على 80٪ الإيثانول مع التحريض لإزالة مركب درجة حرارة القطع الأمثل. ثم، وضع الشريحة على ورقة من رقائق الألومنيوم. Pipette 8 ملليلتر من 1٪ من البنفسجي الكريسيل و 50٪ الإيثانول على الشريحة وصمة عار لمدة 30 ثانية.
غسل الشريحة في أنبوب الثالث يحتوي على 80٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. قم بتجفيف الشريحة عن طريق تمريرها عبر الأنبوب الذي يحتوي على 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية، الأنبوب الذي يحتوي على 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية، وأخيراً الأنبوب الذي يحتوي على الزيلين لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، ضع الشرائح على ممسحة مهمة حساسة لمدة خمس دقائق للسماح للزيلين استنزاف والسماح للشرائح لتجف.
أولا ، تشغيل مجهر التقاط الليزر microdissection ، الليزر ، والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وبدء تشغيل البرنامج. عندما يكون الضوء الأخضر على، اضغط على الزر الأحمر لتنشيط الليزر.
عندما يتحول الضوء إلى اللون الأحمر، يكون الليزر جاهزًا للاستخدام. أدخل غطاء أنبوب PCR 5 ملليلتر في الجامع. Pipette 50 ميكرولترات من التخزين المؤقت استخراج في الغطاء وإدراج جهاز جمع في المجهر.
في إطار جهاز جامع التغيير، انقر على زر الانتقال إلى نقطة مرجعية لنقل جامع إلى نقطة مرجعية. اضبط التركيز لعرض النقطة المرجعية بوضوح. بعد ذلك، انقر فوق الزر إلغاء تحميل اليسار في شريط الأدوات لخفض حامل الشريحة.
ضع الشريحة في الحامل مع قسم الأنسجة التي تواجه لأسفل، وأدخل حامل مرة أخرى في المرحلة. انقر فوق متابعة في نافذة عينة التغيير. لإعداد معلمات الليزر، حدد خيار التحكم في قائمة الليزر أو انقر على أيقونة الليزر.
ضبط المعلمات التالية حسب الرغبة، والسلطة، والتي هي قوة الليزر، والفتحة، وهو عرض الليزر، والسرعة، والتي هي سرعة القطع في وضع التعادل وقطع. ابدأ بهدف 5X للعثور على مجالات الاهتمام ، والتحول إلى الهدف الذي يظهر أفضل مجال الاهتمام. اختيار أنبوب لجمع عن طريق النقر على علامة في جامع، ثم اختيار نقل وقطع أو رسم وقطع.
بمجرد الانتهاء من القطع ، فإن الأنسجة المستهدفة مع غشاء PEN تقع في غطاء أنبوب جمع الجاذبية. كرر عملية الاختيار والقطع هذه لسحب مجالات متعددة من الاهتمام إذا لزم الأمر. بعد ذلك، قم بتفريغ جامع وإغلاق أنبوب PCR بعناية.
ضع الأنسجة المُتَنَكَة على الجليد الجاف. ذوبان الأنسجة microdissected في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة، واحتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تدور العازلة تحلل أسفل إلى أنبوب PCR 5 ملليلتر.
تنفيذ العلاج DNase واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام RNA عزل عدة، اتباع تعليمات الشركة المصنعة. في هذه الدراسة، يتم تنفيذ التقاط الليزر الأمثل microdissection من الغضاريف والعظام، وتسليط الضوء على استخدام التلطيخ البنفسجي cresyl في إجراء سريع لتصور الغضروف والعظام لجمع الأنسجة الدقيقة مع الحفاظ على سلامة عالية RNA للتحليل اللاحق. تظهر ملاحظة الشرائح أن جميع الغضاريف التي تم فحصها هي أرجواني ملطخة ، وجميع الأنسجة المعدنية ملطخة باللون البني أو الأسود.
يتم تمييز كل من الغضاريف والعظام بسهولة عن الأنسجة الأخرى في مواقع تشريحية متعددة. يتم اختيار الغضاريف في ميكل، والغضاريف المخروطية، ومناطق العظام المانائية وعزلها عن طريق التقاط الليزر المجهري. للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتسلسل, سحب 10 مناطق من الغضروف ميكيل, 10 مناطق من الغضروف المتدلل, أو أربع مناطق من عظم المنبع في ثلاثة أنابيب جمع الفردية على التوالي.
ثم يتم استخراج RNA، ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام التحليل الحيوي. ويستخدم هذا القبض على الليزر microdissection بروتوكول على أنسجة مختلفة في مراحل مختلفة من النمو، وقياسات رقم نزاهة RNA تشير إلى جودة عالية RNA. ثم يتم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي.
هناك 4, 006 جينات بشكل ملحوظ ومختلفة أعرب عن بين عظم المنادل والغضاريف ميكيل. الجينات المحددة لعظمات العظام أو الخلايا العظمية هي أكثر تعبيراً عن ذلك في العظام المانبة في حين أن الجينات المحددة في الزخرون هي أكثر تعبيراً في غضروف ميكل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن علامات هشاشة العظام بشكل كبير في العظام المانوية ، مما يشير إلى عزل ناجح للأنسجة المستهدفة.
وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل التعبير الجيني، بما في ذلك qPCR و RNA-seq. ويمكن لهذه الطرق تحليل التعبير الجيني لـ transcriptome في أنسجة أو مناطق معينة ذات أهمية داخل الأنسجة غير المتجانسة.
