该协议概述了免疫治疗恒河T细胞的产生，这种细胞表达两种蛋白质:一种是抗病毒嵌合抗原受体，另一种是将细胞靶向淋巴囊的化疗受体CXCR5。这种相对快速的九天程序产生T细胞，其分化较少的中央记忆表型，输注到动物后具有长期持久性的潜力。将这种方法适应人体细胞，可以生产免疫治疗T细胞，在不给药的情况下，可以诱导艾滋病毒得到持久缓解。
这种方法可以广泛用于产生恒河T细胞，表达其他感兴趣的蛋白质。稍作修改，它可用于在包括人类在内的其他物种中产生转导T细胞。转导的成功取决于健康的刺激PBMC。
在收集、运输和存储时必须小心。在转导之前，必须直观地评估细胞的刺激。首先解冻原发恒河 PBMC。
在37摄氏度的水浴中孵育细胞，轻轻搅拌，直到只保留少量冰。轻轻地将细胞移液到圆锥管中。然后用一毫升的基本介质冲洗小瓶，然后慢慢将其添加到细胞中。
慢慢地向细胞中再添加9毫升温暖基本介质。将管子放在防气溶胶罐中，在 22 摄氏度下以 600 倍 g 离心 5 分钟。吸制上一液，并在少量生长介质中重新暂停颗粒。
要计算细胞数，在10微升的尝试蓝色细胞中加入10微升的细胞。装入室滑梯并将其插入计数器。按下捕获按钮可计算单元格数。
计算细胞总数，乘以体积乘以细胞浓度，并在生长介质中稀释到每毫升200万个细胞。加入抗CD28，最终浓度为每毫升5微克。然后移液三到六百万细胞每井到抗CD3涂层板。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板两天。将离心机加热到32摄氏度，以2000次g运行约30分钟。同时，在37摄氏度的水浴中加热无血清和生长介质，并在37摄氏度的水浴中轻轻旋转，解冻病毒。
然后把它放在冰上。将病毒稀释到无血清介质中预先确定的最佳感染倍数。将稀释的逆转录病毒的两毫升添加到纤维素涂层板的每个井中，仅使用介质进行阴性控制细胞。
将板放在预预热离心机中，放在微孔板托架中，以2000倍g离心，两小时。如果立即使用，从井中吸出病毒制剂，并添加两毫升的生长介质。在倒置显微镜下检查受刺激的 PBMC。
细胞应该是圆的，明亮的，他们应该折射光。他们也应该有一个团块的外观指示刺激。收集目标细胞，并转移到50毫升锥形管。
用一毫升的生长介质冲洗每口井一次，然后加入管中。然后像之前演示的一样计算单元格。在32摄氏度下，以600倍g离心细胞，在32摄氏度下5分钟，使细胞产生离心。
从颗粒中吸出介质，以每毫升150万细胞的浓度重新在生长介质中重新暂停细胞。在每个病毒涂层的井中加入一毫升的细胞悬浮液，并将MAC转导细胞添加到未感染病毒的纤维素涂层井中。在32摄氏度下以1000倍g离心，10分钟，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育48小时。
使用恒河细胞和伽马逆转录病毒需要使用个人防护设备，如实验室外套和手套，工作必须在生物安全柜中进行。所有移液器和溶液都必须除污染。用五毫升移液器上下移液每个孔的内容，以重新暂停细胞，并将它们转移到50毫升的圆锥管。
向每个井添加一毫升的生长介质，并上下移液器去除粘附细胞。然后像前面描述的那样计算单元格。在25摄氏度下以600倍g离心细胞，10分钟。
然后吸气介质，将扩张介质中的细胞重新暂停到每毫升一百万个细胞的浓度。将五毫升细胞放入六井板的每个气体渗透井中，并仔细分层每井另外25毫升的扩张介质。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞，为期四天。
要从孔中收集细胞，请取出并丢弃20毫升的介质，注意不要干扰细胞。上下移液剩余的介质，以移出细胞。使用无菌转移移液器用三毫升的介质冲洗每口井并收集残余细胞。
然后计算它们以检查细胞数和生存能力。该协议用于六种不同动物的细胞的转导和扩张。气体渗透井的起始密度为500万细胞，经过四天的生长，每口井的中位密度达到5560万个细胞。
在整个协议中，通过 trypan 蓝色排除监测的细胞的生存能力保持在83%至95%。流细胞学用于观察转导基因的共同表达。第五天，使用CD4-MBL CAR和CXCR5对42.8%的细胞进行转导。
在第九天，中值表达式为47.6%，单轮转导。流细胞学也用于监测记忆表型。在转导和扩展之前，识别了天真的中央记忆和效应器记忆群。
天真的人口随着培养而丧失，细胞在第五天和第九天主要是中央记忆细胞。转导的成功取决于高质量试剂、高度可行的细胞和滴定病毒的使用，以及一致遵循协议的时间。这些细胞可用于功能性测定，包括迁移和病毒抑制检测，以及输液到动物进行临床前研究，以测试免疫疗法的疗效。
我们已经推进了对动物中的 CAR 和 CXCR5 T 细胞的临床前测试，并希望很快在艾滋病毒感染者身上测试这种免疫疗法。
