从鸡蛋黄中分离脂蛋白颗粒,研究细菌病原体脂肪酸并入膜磷脂

该协议为研究将复杂宿主源的外源脂肪酸纳入细菌膜，特别是金黄色葡萄球菌提供了一个框架。该协议利用无偏见的脂质分析和从蛋黄中分离的脂蛋白颗粒作为复杂脂肪酸的经济来源，以量化脂肪酸在细菌脂质中的结合。此处描述的质谱技术为金黄色葡萄球菌脂质的脂肪酸剖面提供了无与伦比的视角，但可以适应其他细菌膜的研究。

执行此协议时，应注意每个分馏步骤，以识别和保留包含 LDL 的分数。从血浆分数中去除硫酸氨对低密度脂蛋白的下游应用至关重要。

首先，用30毫升无菌磷酸盐缓冲盐水洗两次蛋黄，以去除残留的白素。用无菌移液器尖端刺穿葡萄干膜，将膜内装物排入无菌的 50 毫升锥形离心管中。在pH7下加入约24至30毫升或17摩尔氯化钠溶液，加入蛋黄并大力混合。

然后将管子放在摇摇器上，在4摄氏度下混合60分钟。将蛋黄稀释在10摄氏度，在10，000倍g下，45分钟。将上流液液分转移到无菌的 50 毫升圆锥管中，留下颗粒颗粒分数。

和离心机再次。首先，在4摄氏度的摇床或类似装置上，将等离子体分数与40质量体积百分比硫酸铵混合60分钟。调整pH值后，在4摄氏度和10，000次g下将等离子体部分离心，持续45分钟。

将上半固体黄色部分去除为七千多孔大小的透析管。在油管中提供至少 25% 的额外空间，以便其膨胀。将透析管放在三升超纯水中，在三摄氏度下通宵透析，以去除硫酸铵。

透析后，将溶液在四摄氏度下离心，如前所述。小心地将上半固体黄色部分取出到无菌管中，并在四摄氏度下储存。经过隔夜孵育的培养，将500微升转移到两个无菌的250毫升的困惑烧瓶中，其中含有49.5毫升的1%的尝试酮汤。

在37摄氏度下孵育约4小时，摇晃至中长相。以25毫升的增量将100毫升培养器转移到4个无菌的50毫升离心管中，并在10，000倍g下离心四管，使细胞产生颗粒。去除上一提液，并在 750 微升 1% trypton 肉汤中重新悬浮每个细胞颗粒。

将四个 750 微升电池悬浮液组合到一个 15 毫升管中。和等分350微升的细胞悬浮成6个无菌的1.5毫升离心管。使用移液器将30微升LDL加入1.5毫升离心管，达到5%的最终浓度，并在37摄氏度下孵育，摇晃4小时。

在4摄氏度下以16，000倍g将培养物离心，持续两分钟。并在330微升无菌磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮细胞颗粒进行清洗。再重复一次。

通过减去空管的重量记录六个湿细胞颗粒的重量。在干冰上捕捉细胞颗粒。首先在每个细胞颗粒上加入一勺5毫米氧化硅珠。

将 740 微升 75%HPLC 级甲醇直接加入到零下 80 摄氏度的管中。然后添加两个微升的50微摩尔二甲基磷脂酰胆碱作为内部标准。将含有 1.5 毫升离心管的样品放入子弹搅拌机组织均质器上的可用端口中。

在低速时使样品均质化。设置 2 到 3 三分钟。目视检查样品的均匀性。

如果细胞团可见，则以两分钟为增量在子弹搅拌机中继续均质化。接下来，在化学烟罩的每个样品中加入270微升氯仿。用力旋转样品30分钟。

将样品在台式离心机中离心长达30分钟，至少2000次。在化学烟气罩中，收集单相上清液并转移到新的试管中，同时小心地避免提取管底部的蛋白质颗粒。将先前准备的稀释脂质提取物转移到适当的自动采样器小瓶中。

对于基于流量喷射的分析，将自动采样器小瓶放入 HPLC 系统的温度控制自动采样器中，该系统能够进行毛细管流应用。根据手稿设置 HPLC 系统。通过装有低流量 34 仪表金属针的电喷电离源，从 HPLC 传输线引入质谱仪。

在热调 Plus 仪器控制软件中，将电离电压设置为 4，000 伏特，将护套气体设置为 5。同样，将毛细管温度设置为 150 摄氏度，将 S 镜头设置为 50% 单击定义扫描按钮，并在分析仪菜单中选择 FTMS。将质量范围字段设置为正常，在分辨率字段中，选择 100，000。

确保扫描类型设置为已满。在扫描范围菜单下，在第一个质量字段中输入 200，在最后一个质量字段中输入 2，000。在进一步定义观测质量精度后，在总离子色谱图中对宽峰的信号进行平均。

右键单击大容量频谱查看窗口中的拇指标记图标，然后选择视图频谱列表。从同一菜单中，选择显示选项，然后在显示菜单中选择所有峰值切换框。单击"正常"按钮以关闭查看窗口。

右键单击大容量查看窗口中的拇指标记图标，然后选择导出剪贴板的精确质量。将第一个工作表的导出数据单元格 A1 粘贴到新的 Excel 电子表格中，然后根据手稿继续操作。要执行准确的质量脂质识别，请打开 LIMSA 软件。

从主菜单中，在频谱类型菜单下选择峰值列表。选择正模式或负模式，以与获取质谱数据中的极性相对应。在峰值全宽（最大值一半）和超过 z 窗口时，输入所需的质量搜索窗口以查找峰值。

在该协议中，30至40千达吨β悬浮素的沉淀进一步丰富了等离子体分数的LDL含量。140、80、65、60和15千元以下的蛋白带的存在与低密度脂蛋白的蛋白相关。 三氯生治疗抑制无脂肪酸介质中金黄色葡萄球菌的生长。

同时补充蛋黄血浆作为外源脂肪酸来源的培养物，克服了三氯生引起的生长抑制。同样，用丰富的蛋黄LDL补充三氯生处理的培养物可以恢复生长。此外，蛋黄LDL的添加支持以前特征的S.aureus脂肪酸，奥索特罗菲的生长。

通过采用流量注入高分辨率的精确质谱法，以1%的尝试性汤或蛋黄LDL测量脂肪前酸含量。发现少量自由脂肪酸。正交部分最平方鉴别分析丰富的金黄色葡萄球菌膜磷脂证明分明分类分离，具有未经处理的脂肪酸成分和蛋黄LDL处理条件。

从蛋黄中富集低密度脂蛋白为研究细菌病原体和宿主脂蛋白之间的相互作用提供了廉价的复杂脂肪酸来源。用于制备脂质提取物的氯仿和甲醇是危险的。请务必在化学烟罩中使用这些试剂，并包含所有废物流。