台湾蝙蝠种群感染病毒监测的标准操作程序

莱萨病毒是一种动物园无病原体。为了评估台湾蝙蝠种群中是否存在莱萨病毒，我们启动了一个监测计划。2016年到2018年，它成功鉴定了四种莱莎病毒。

该协议是台湾病毒监测的分步介绍。我们希望对研究对病毒病毒监测感兴趣的人有用。连接正确的 tac-keg 符号非常重要。

死亡或垂死的蝙蝠比活蝙蝠更适合对莱萨病毒的监测。根据实验室所在地国家的生物安全法规;在合适的生物安全水平实验室中执行以下程序。并确保研究人员目前合格并穿戴适当的个人防护装备。

在收集弱蝙蝠或病蝙蝠或尸体后，让蝙蝠生态学家根据标本的形态特征识别蝙蝠物种。向实验室提交信息表，包括每个蝙蝠标本的采集地点、物种、临床体征和其他相关数据。在开始坏死镜检查之前，检查所有外部孔并拍摄蝙蝠的外部特征，特别是头部、耳朵和翅膀，以进行物种分化。

收集口服拭子样本，将蝙蝠放在腹间，放在无菌解剖板上，用钳子固定头部。使用手术刀沿着小腿区域的中线切割皮肤;将皮肤拉到侧边，沿着小腿区域的中线在头骨上切口。用钳子打开头骨，露出脑组织，用钳子轻轻地将脑组织与连接的神经组织分离。

切割大脑的横截面，包括脑干和小脑，用玻璃滑梯轻轻触摸脑组织的切面，留下涂片印象。按镜头组织上的幻灯片去除多余的组织，并在零下 20 摄氏度丙酮中固定涂片压片幻灯片 30 分钟。然后修复一小块新鲜脑组织，在形式，组织病理学检查。

将其余组织放在emi-em 10中，用于核酸提取。接下来，沿着身体的中线将皮肤从歧管切到 Anus，并使用钳子抬起和分离皮肤并下划肌肉组织;允许收集位于曼迪贝骨附近的唾液腺。用钳子稍微抬起胸骨，用手术刀沿着中线切割胸骨和腹壁，并切割夹骨。

使用针头将左右肋骨笼固定到解剖板上，打开胸腔。并记录整个军团和验尸后的变化程度。然后使用钳子和手术刀去除内脏组织，以适合计划下游分析。

要在固定结束时进行直接荧光抗体测试，干燥涂片印象幻灯片，并选择至少两个荧光结合抗狂犬病抗体进行分析。通过0.45微米滤株将一个抗体过滤到每张幻灯片上。在潮湿的室内，在37摄氏度的温度下孵育滑梯30分钟。

在孵育结束时，排出多余的结合，用PBS清洗幻灯片。然后使用 10% 甘油的小体积将盖滑到幻灯片上，然后通过荧光显微镜对幻灯片进行图像。当荧光抗体测试或RT-PCR分析显示正性时，在emi-en 10的10%悬浮液中使大脑标本均质化，通过离心沉淀组织。

接种200微升的超级nat-en与三倍10至第6小鼠神经母细胞瘤细胞和1毫升emi-en10在37摄氏度和1%的二氧化碳1小时一小时。将大脑同质细胞悬浮液转移到一个25厘米的方形烧瓶中，里面装着6毫升的新鲜emi-en10。在一毫升脑均质细胞悬浮液中放入四孔特氟隆涂层的玻璃滑梯中，直径为六毫米，将滑梯在37摄氏度和1%的二氧化碳下放置3至4天。

用100%丙酮固定后，用荧光抗体测试中使用的两种荧光结合抗狂犬病抗体染色幻灯片。并且通过荧光显微镜对幻灯片进行可视化，以确定内特拉西达-普拉斯-米内含物的数量。在根据标准协议对接种的细胞培养进行试青素和亚培养后，将冷培养物返回细胞培养箱三到四天，重复计算受感染的细胞数量，直到达到100%的感染率。

从2014年1月到2017年5月，收集了13种332只蝙蝠尸体进行监测。在两个阳性蝙蝠病例的这种代表性分析中，使用荧光抗体测试对阴性测试，使用其中一种商业的、拟合的抗狂犬病抗体，而采用两种不同底型集的RT-PCR则均呈阳性结果。在Gen银行数据库中对获得的放大器序列进行爆炸查询的主观显示，序列与身份小于79%的Lyssa病毒相似，支持检测到的Lyssa病毒的身份。

随后，荧光抗体测试和测序确认，两种Lyssa病毒随后从两个大脑中成功分离。确定莱萨病毒阳性率的关键步骤是荧光抗体测试和RT-CPR分析。强烈建议在底光组中使用两种或两种或两种（多）抗狂犬病抗体。

除了莱萨病毒外，还可以使用封闭式诊断方法监测其他动物非病毒蝙蝠病原体。然后，这些数据可以用来告知公众避免与蝙蝠接触。我们越能够研究蝙蝠莱萨病毒，我们越能够了解其演变和对公共卫生的影响。