原发性白血病细胞代谢谱的评价

这种方法可以帮助回答有关白血病细胞代谢途径设置的关键问题。该技术的主要优点是，它允许测量原发性白血病细胞在活细胞中的实时代谢。首先以一比一的比例稀释从PBS中从白血病患者获得的骨髓样本。

小心地，将稀释的骨髓样本的六毫升层层，在15毫升锥形管中，在新鲜制备的密度梯度介质中，用六毫升的密度梯度介质分离细胞，通过密度梯度离心分离细胞。使用巴斯德移液器小心地将单核细胞的接口层转移到一个新的 50 毫升锥形管中，该管含有 5 毫升 PBS，用于离心洗涤。然后，将单核细胞颗粒重新在两毫升无菌PBS中重新计算。

稀释细胞到三倍10到七个细胞每毫升浓度。在两个含有20毫升RPMI介质的T75烧瓶中加入1毫升细胞，在37摄氏度和5%CO2下进行16至24小时的孵育。同时，为准备细胞外通量分析板，在两个、八个孔的细胞外通量分析仪板的每个孔中加入12.5微升的细胞粘合剂溶液。

20分钟后，吸气细胞粘合剂，每次洗涤用200微升无菌水洗两次每井。第二次洗涤后，将板留在机罩中，直到水井干燥。将传感器墨盒倒置在实验室工作台上。

分离流量分析仪的公用板和传感器盒。并在公用板的每个孔中用200微升的卡兰特填充，并在井外侧用400微升的卡兰特填充每条护城河。将传感器盒返回到现在包含校准器的公用板，将墨盒组件放在加湿的 37 摄氏度培养箱中，过夜时不带 CO2。

然后打开细胞外通量分析仪，让它在一夜之间加热到37摄氏度。第二天早上，将细胞从烧瓶转移到50毫升锥形管进行离心。将颗粒重新用一毫升适当的实验介质重新暂停，用于计数。

将细胞以四倍十0重新作用，以四倍十次将六个细胞重新用于实验中浓度的四微升。并在通量分析仪板的B至B孔中加入50微升细胞。并将180微升的实验介质打入井中，以H、H为背景控制井。

离心缓慢并小心地将130微升的实验介质添加到B型井B-G.，并在显微镜下直观地确认细胞稳定地粘附在每口井的底部。然后将通量分析板返回加湿的 37 摄氏度培养箱，无 CO2 30 分钟。在孵化结束前 20 分钟，根据表中所示的实验协议，将化合物加载到墨盒的适当喷油器端口中。

然后建立相应的细胞外通量分析程序。启动程序，并在提示时将校准板替换为检测板。在糖解压力测试中，只使用基础介质，使细胞缺乏营养。

获得的第一个参数是基础酸化，它应反映细胞中储存的葡萄糖量。第一次注射后，细胞外酸化率增加，因为细胞利用葡萄糖，可以发酵葡萄糖到乳酸。第二次注射中的寡霉素A抑制ATP合成酶，从而引导细胞主要通过糖解产生ATP，从而导致细胞外酸化率的进一步升高。

而注射2-脱氧-D-葡萄糖完全抑制糖解和细胞外酸化率下降。在细胞米托压力测试中，使用谷氨酰胺和葡萄糖补充的培养基，使细胞不会被剥夺所有营养。基础呼吸参数反映其基础代谢状态。

第一次注射寡霉素 A 后，细胞抑制线粒体呼吸，并切换到糖解，这表示氧气消耗率的下降。然而，第二次和第三次注射FCCP，将ATP生产与呼吸耦合，使细胞现在以最大速率消耗氧气。氧气消耗率上升到最高值。

最后一次注射罗酮和抗霉素混合物完全抑制线粒体呼吸，将耗氧率降至几乎为零。在尝试此程序时，必须评估样本中爆炸的百分比，以确保仅测量白血病细胞的代谢参数。在实现此方法时，必须仔细优化栽培条件和数据规范化。