大鼠直接迷走神经注射方案

我们提出了一种大鼠直接迷走神经注射的方案，能够将药物直接输送到神经中，而不会出现注射后并发症。该方法适用于涉及自主神经系统作的临床前神经学研究。它可用于大鼠和其他物种的其他神经的直接神经注射，并进行必要的修改。

有相对丰富的策略和方法可以促进药物输送到中枢神经系统。然而，药物直接递送到周围神经系统不太常见，可用于帮助研究人员的详细方法出版物较少。在这里，我们描述了一种用于周围神经系统药物输送的直接神经注射方法，使用迷走神经作为模型神经。该方法可通过靶向左迷走神经用于治疗自主神经系统疾病，尽管这种一般的注射方法可以外推到注射其他神经，只需稍作修改。该方法解释了在解剖显微镜下对麻醉成年大鼠进行显微外科手术所涉及的程序中涉及的所有关键步骤。描述了示踪染料的使用，以促进实时监测注射保真度。提供了成功和失败的进样图。如果作得当，可以直接迷走神经注射以安全的方式进行，大鼠耐受性良好，没有产后并发症。例如，一旦外科医生接受了这种方法的培训，六只大鼠中有六只成功注射，没有任何并发症。这种用于临床前大鼠研究的直接神经注射方法能够将药物（包括但不限于基因治疗）输送到周围神经。

应用正确的给药方法是获得成功治疗效果的关键因素之一。尽管有大量将治疗剂递送至中枢神经系统 （CNS） 的方法，但只有少数方法报道通过直接神经注射进行周围神经系统 （PNS） 递送。直接神经注射，例如注射到大鼠的背根神经节 （DRG） 中，已在临床前研究中尝试，以更好地了解疼痛机制、药物毒性、基因转移 ^1,2,3 和一般方法开发 ^1,4。关于直接神经注射的其他报告包括大鼠⁵ 和小鼠⁶ 的脊神经注射⁴ 、坐骨神经注射¹ 和迷走神经注射。最近提出了一种软骨上注射方法，以更好地将治疗剂分配到兔子的视神经头^{中 7}。

由于 DRG² 中细胞体的感觉功能，DRG 被认为是直接注射转基因负载载体（如腺相关病毒 （AAV））的理想位置。已经描述了 DRG 注射的手术和非手术方法 ^1,8。然而，关于 DRG 注射非手术方法的结果一致性，已经发现了有争议的结论¹。涉及部分椎板切除术的手术方法被认为对大鼠 DRG 注射 100% 成功，而行为结果没有任何改变³，以及涉及小鼠部分截骨的方法⁹。几项研究报道了药物递送的 DRG 注射方法，该方法已用于大鼠和小鼠的临床前基因治疗研究 ^1,2,10。涉及局部注射的基于载体的基因治疗研究可能包括以下益处：减少脱靶表达，降低全身毒性，降低病毒载量和注射量，降低免疫原性并发症的风险^11,12。

已经尝试了直接注射到坐骨神经（身体最长的神经）的方法，方法是将右坐骨神经暴露在大鼠的大腿中部水平。该方法使用配备微处理器控制进样系统的拉式玻璃移液器以 1.2 μL/min 的流速¹ 注射总体积为 10 μL 的染料。该实验表明，在 DRG 水平上缺乏染料分布，并且分布主要局限于注射部位周围。同样，已经尝试了其他直接神经注射方法，例如脊神经注射，以评估大鼠的适当注射量和染料分布模式。2 μL 建议最适合脊神经注射，而 DRG 注射的 3 μL 染料显示大鼠背侧和腹侧根神经节的分布¹。据报道，根据菌株和体型，小鼠 DRG 注射量在 1.0 μL 至 1.5 μL 之间最佳 ^2,9。

大鼠⁵ 和小鼠⁶ 采用直接迷走神经注射法，评价神经损伤或细胞完整性在转移人 α-突触核蛋白中的作用。这两项研究由同一组研究人员进行，描述了一种将 AAV 载体直接注射到颈部左侧迷走神经的简要方法。在大鼠中，该方法涉及使用尖端直径为 60 μm 的玻璃毛细管，用 5 μL Hamilton 注射器以 0.5 μL/min 的流速注入 2 μL 载体。在小鼠中，使用安装在 10 μL NanoFil 注射器上的 36 G 钝钢针头，以 160 nL/min 的流速注射总体积为 750 nL 的载体溶液⁶。这些实验表明，转基因在大鼠和小鼠的脑桥和中脑的轴突中递送和表达。同样，左侧迷走神经的背侧运动核显示与转基因的阳性免疫反应。这些证据表明，直接迷走神经注射方法可能是基因治疗中的一种可靠方法，其中细胞转导延伸到大脑的多个位置，这些位置通过迷走神经投射轴突。但是，这些方法没有提到使用任何染料来跟踪注射保真度。

在这里，描述了一种使用无毒示踪染料直接注射到左迷走神经的方法，该方法主要适用于临床前研究中的研究人员。讨论了可能导致药物输送困难的潜在陷阱以及克服它们的方法。这些情况用图片说明，以说明导致交付不成功的原因以及使交付成功的方法。

以下协议是根据机构伦理指南和机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准进行的。

1. 房屋准备

注意：该方案适用于至少 2 个月大的成年大鼠。较小的动物（包括小鼠和年轻的大鼠）是可能的，但不推荐这样做，而且会困难得多。

1. 在迷走神经手术前 48 小时提供湿的食物或任何其他软食（兽医恢复凝胶）。由于动物在手术后可能会遇到进食困难，因此在手术前将这些物品介绍给动物，以帮助它们熟悉这些物品的味道并诱导进食动机。
2. 在手术前至少 1 周以及手术后 1 周将大鼠单独饲养在笼子中。这将使它们能够适应独处的压力，并防止同窝伴侣在手术后刮伤伤口。

2. 准备手术物品和空间

1. 提前列出所有必要的物品，并仔细检查所有物品是否可用于手术。
2. 手术前用适当的消毒方法对所有物品进行消毒。
3. 在解剖显微镜下设置无菌手术空间。在显微镜下放置一个加热垫，以在手术过程中保持大鼠温暖。
4. 将所有手术材料放在无菌窗帘上的手术台上。在解剖显微镜下为手术留出足够的空间。确保显微镜的焦点处于最佳状态并包含手术区域以观察神经。
5. 将注射泵放置在靠近手术阶段的位置，使管子的长度足以到达注射部位。
6. 将手术工具放在外科医生惯用手的一侧。

3. 制备候选药物和示踪染料的混合物

1. 确保将候选药物稀释至推荐稀释剂中的所需浓度，使 5 μL 药物与染料混合，得到所需量的候选药物。建议直接迷走神经方法的最大注射量为 5 μL（包括示踪染料，参见步骤 3.2）。
2. 将相容染料与候选药物混合，以实时跟踪注射保真度。例如，终浓度为 1% Luxol Fast Blue 或 0.002% 荧光素的染料是兼容的染料。
   注意：在染料和候选药物混合物中使用最佳浓度的染料。当混合物中的染料浓度过低时，可能无法跟踪进样。当染料浓度过高时，可能会导致混合物太稠，粘度高，会堵塞注射针。

4. 将候选药物和染料混合物装入管路中

1. 将 100 μL 玻璃注射器（去除柱塞）连接到 27 G 针头上。
2. 将大约 45 cm 的消毒聚乙烯管的一端连接到 27 G 针头。
3. 取一个 3 mL 塑料注射器，并用 27 G 针头装上。向注射器中加入约 0.5 mL 的 0.9% 生理盐水。
4. 从开口端用 0.9% 生理盐水填充聚乙烯管，以填充管子的整个长度和玻璃注射器的整个桶，直到它溢出。
   注意： 避免气泡滞留在管道内至关重要。
5. 取出并丢弃 3 mL 注射器和针头。
6. 将注射器柱塞插入玻璃注射器的针筒中，并将其略微向前推至针筒中间。
7. 将玻璃注射器放入注射泵中。
8. 使用注射泵将柱塞稍微向后拉，在管子长度的开口端形成约 1.5 cm 的空气空间。
9. 用 10 μL 微量移液器吸取至少 5 μL 染料和候选药物混合物，并将其滴到消毒的封口膜上。
10. 通过注射泵将柱塞拉回，将候选药物混合物吸入管路中。保持 0.9% 盐水和注射溶液之间的气泡，否则，请避免在注射溶液中捕获任何气泡。用记号笔标记管路中注射混合物的液位。
    注：候选药物染料混合物与管道内的无菌盐水之间的气隙对于防止两种溶液混合至关重要。
11. 将 35 G 针头与管路安装。用胶带将针头固定在手术台的干净表面上，使针头不会松动，不会移动和接触其他任何东西，并保持消毒状态。

5. 注射针的灌注

1. 将注射泵程序设置为分配 0.5 μL/min。
2. 启动注射泵约 10-15 秒，直到注射液开始从针尖流出。在针头尖端有少量混合物，在管路和注射针的接头处（或注射器、管路或针头长度上的任何其他位置）没有泄漏，表明设置正确。
   注意： 如果在针尖没有看到微小的液滴，则表明针头堵塞。由于候选药物和染料混合物的高粘度、系统内滞留的过多空气以及玻璃注射器未正确安装在注射泵内，可能会发生针头堵塞。参见 图 1 了解针和管路之间连接处的泄漏示例。启动至关重要，因为它有助于确定针头是否畅通无阻，以及神经内的注射是否顺利通过。

6. 大鼠手术准备

1. 获取大鼠的体重以计算镇痛药的必要剂量。例如，卡洛芬以 5 mg/kg 的剂量率皮下注射大鼠。
   注意：建议卡洛芬在注射前储存在 4 °C 下。
2. 用异氟醚蒸发器以 3%-4% 的流速麻醉大鼠诱导麻醉约 2-3 分钟。将异氟醚流速降低至约 1.75%-2% 以维持麻醉。
3. 将大鼠转移到单独的桌子上，并设置脱毛和部位准备。确保此桌子靠近手术空间。
4. 在大鼠的双眼涂抹人工泪液软膏，以防止过度干燥。
5. 根据批准的机构动物方案施用镇痛药，以控制大鼠恢复意识时的疼痛。
6. 用理发器在颈部腹侧的颈部颈部区域剃除手术区域。从下巴到胸骨，从两侧的中线垂直距离最多剃掉约 2 厘米。
7. 用 70% 乙醇和 10% 优碘对该区域进行消毒，交替用酒精棉签和聚维酮碘擦拭该区域 3 次。从区域中心向外以圆形方式擦拭。
8. 将大鼠在显微镜下以仰卧位转移到手术阶段。调整显微镜的焦距以可视化颈部区域的手术区域。

7. 进行大鼠手术，将候选药物直接注射到左侧迷走神经中（图 2、图 3 和 图 4）

注意：这部分方法需要第二个人来协助外科医生。

1. 将大鼠仰卧在与安装灯相关的解剖显微镜下的加热垫上。
2. 用一块不可吸收的缝合线钩住大鼠的前上颌牙齿，并将缝合线的开口端固定在鼻锥内，以便大鼠的鼻孔在整个麻醉过程中始终位于鼻锥内。
3. 放置大鼠的位置，使其头部位于惯用右手外科医生（或惯用左手外科医生）的左侧。在这个位置，外科医生的前侧垂直于大鼠的身体。在脖子下放一个消毒规垫，调整大鼠颈部的角度，使颈部变得笔直。这将使定位左侧迷走神经并进行注射变得更加容易。
4. 用消毒过的窗帘覆盖大鼠的整个身体，保持手术空间开放。
5. 用 4 个带有弹性体的磁性固定器分别固定四个牵开器销，并将固定器放置在手术台的四个角。
6. 在切口所在的颈部区域的中线表皮上注射局部麻醉剂。例如，通常使用利多卡因和布比卡因的混合物。
7. 在下巴和胸骨之间的中线处做一个约 2 厘米长的纵向皮肤切口，在颈部区域的颈部腹侧使用手术刀刀片（图 3A）。
8. Blunt 用消毒棉签将皮肤的切割边缘分开。
9. 在牵开器尖端的帮助下，从切口部位向相反的方向缩回皮肤边缘。
10. 用棉签将面部分开，以更深入。将唾液腺推向外侧。
11. 用棉尖分开胸骨突肌，然后用销钉将它们缩到一边。随着胸骨肌分离的扩大，气管出现在中间，覆盖着胸骨舌骨肌（图 3B）。
    注意： 小心不要对气管施加压力。
12. 推进大鼠气管左侧的组织分离，直到出现颈动脉鞘，其中包含与左侧迷走神经一起运行的颈总动脉。
13. 用细镊子小心地在颈动脉鞘上打一个小尖孔，注意不要在显微镜下损伤颈动脉。用细镊子将左侧迷走神经与颈总动脉分开。
    注意：手术区域在解剖学上至关重要。颈动脉壁厚、滑、不易受伤，但细镊子的锋利尖端可能会损伤它，并可能发生出血。同时，要注意不要伤到神经。
14. 一旦神经被镊子与动脉分离，使用安装在该孔中 1 mL 注射器上的 25 G 弯曲针头“钩住”并用非惯用手握住神经（图 4A）。
    注意：弯曲针的尖端是钝的，以免伤害神经和动脉。使用止血钳将针尖的曲率角度定制为约 90°（图 2）。
15. 用惯用手握住装有候选药物染料混合物的针头，沿神经运行的方向轻轻刺破神经，使针头的斜面朝上。
    1. 为了轻松刺破，请使用 25 G 钩轻轻拉动，保持神经伸直。将针头插入神经并向前推进 0.5 厘米以上，同时保持针头与迷走神经平行。然后，稍微向后拉，使大约 0.4-0.5 厘米的针头留在神经内。
       注意：针头的角度应足够浅，以便穿透神经内部而不穿过另一侧。
16. 有时，在启动时针头在神经外畅通无阻，但候选药物-染料混合物不能顺利通过神经内部。为避免这种情况，请限制单针刺伤神经的次数不超过 3 次。如果针头变钝，堵塞或其他注射不良的机会将增加。
17. 确保针头完全在神经内。保持位置不动并打开注射泵。
    注意：仔细检查注射部位，查看候选药物-染料混合物没有从神经中回流。
18. 在注射过程中，不断检查输液是否留在神经内并顺利流动。使用输液管上所做的标记监测药物 - 染料混合物从起点开始的运动。
    1. 如果候选药物 - 染料混合物流动不顺畅，请将针头拉出并重复引发步骤（步骤 5.2）。然后将针头重新插入神经并恢复输注。
19. 神经开始产生染料的颜色（图 4B）。以 0.5 μL/min 的速度继续输注 10 分钟，以注入所有 5 μL 的候选药物-染料混合物。
    注意：建议根据需要用少量温热的 0.9% 无菌盐水冲洗暴露的组织，以防止过度干燥和损伤。
20. 注入 5 μL 且注射泵停止后，将针头再保持 1 min，以使所有候选药物-染料混合物从注射部位扩散。取出针头。
21. 取下 25 G 弯曲针。使用无菌棉签轻轻地将组织移回原位。拆下牵开器尖端。
22. 用不可吸收的缝合线缝合伤口（也可以使用可吸收缝线）。如有必要，在缝合之间涂抹少量组织胶以完美闭合伤口。

8. 大鼠的术后护理

1. 伤口闭合后，皮下注射约 3 mL 0.9% 温盐水。这有助于老鼠立即补充水分。
2. 将大鼠置于热源中，直到它从麻醉中完全恢复到正常状态。请注意在恢复过程中观察到的任何异常。
   注意：如果神经注射程序需要很长时间，恢复时间可能会更长。
3. 将大鼠转移到它的家笼中，在笼子的地板上放上湿润的食物。确保始终有水。术后观察大鼠约 2 小时，以确保大鼠不感到寒冷。
   注意：如果感觉很冷，请将老鼠放在热源中额外放置几个小时。
4. 在术后 12 小时、 24 小时、 36 小时、 48 小时和 72 小时监测大鼠，并附有书面观察记录。根据批准的机构动物方案重复镇痛药以控制疼痛。例如，卡洛芬以 5 mg/kg 的速率皮下注射 2 次，间隔 24 小时。如果大鼠疼痛持续超过 48 小时，请咨询兽医。
5. 根据大鼠的情况，在 24 小时重复皮下注射约 3 mL 0.9% 温盐水。
6. 继续评估伤口。确保伤口干燥且正在愈合中。
   注意：伤口发红、肿胀和疼痛，大鼠不活动和暗沉可能是伤口发炎的迹象，可能需要额外的兽医咨询。疼痛的大鼠会出现驼背、荷叶边外套、红眼睛和不活跃的状态。它通常位于笼子的一角。
7. 伤口愈合后 2 周内取下不可吸收的缝合线。

本研究使用了 6 只成年大鼠 （3 只雄性和 3 只雌性）。在六只大鼠中，一只大鼠被多次注射以证明注射失败的情况，显示染料在注射部位周围扩散图 5A。所有其他大鼠均表现出平滑的注射和神经染色，如图 4B 和 图 5B 所示。

直接注射到大鼠左侧迷走神经的方法可以安全进行，并且没有术后并发症。药物输送到迷走神经可用于靶向自主神经系统 （ANS）。这涉及某些需要练习和中度至高度手术技能的关键步骤。

这种外科手术需要对大鼠进行平衡全身麻醉。外科医生的目标是在较短的时间内完成手术，以限制麻醉剂的暴露以实现更好的恢复，尤其是在老年大鼠中。该方法?...

作者 NR 和 XC 没有利益冲突。RMB 和 SJG 是与通过迷走神经注射将基因转移到 ANS 相关的知识产权发明者（美国专利 #11,753,655）。SJG 和 RMB 获得了 Taysha Gene Therapies 的特许权使用费收入，SJG 获得了 Taysha Gene Therapies 的咨询收入。

我们要感谢 UT 西南动物资源中心设施安排大鼠手术空间。这项工作的资金由以下来源提供给 SJG：NIH/NINDS R01 NS087175、Hannah's Hope Fund 和 Taysha Gene Therapies。