بروتوكول حقن العصب المبهم المباشر للفئران

Nanda L. Regmi; Xin Chen; Rachel M. Bailey; Steven J. Gray

doi:10.3791/67820

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم بروتوكولا للحقن المباشر للعصب المبهم في الفئران ، مما يتيح توصيل الدواء مباشرة إلى العصب دون مضاعفات بعد الحقن. تنطبق هذه الطريقة على الدراسات العصبية قبل السريرية التي تنطوي على التلاعب بالجهاز العصبي اللاإرادي. يمكن استخدامه لحقن الأعصاب المباشر للأعصاب الأخرى في الفئران والأنواع الأخرى ، مع التعديلات اللازمة.

Abstract

هناك وفرة نسبية من الاستراتيجيات والمنهجيات لتسهيل توصيل الدواء إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن توصيل الدواء مباشرة إلى الجهاز العصبي المحيطي أقل شيوعا ، مع وجود عدد أقل من منشورات الطرق التفصيلية لمساعدة الباحثين. هنا ، نصف طريقة حقن العصب المباشر لتوصيل أدوية الجهاز العصبي المحيطي ، باستخدام العصب المبهم كعصب نموذجي. يمكن استخدام هذه الطريقة في علاج اضطرابات الجهاز العصبي اللاإرادي من خلال استهداف العصب المبهم الأيسر ، على الرغم من أن طريقة الحقن العامة هذه يمكن استقراءها لحقن أعصاب أخرى مع تعديل طفيف. تشرح هذه الطريقة جميع الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها الإجراء الذي يتضمن الجراحة المجهرية في الفئران البالغة المخدرة تحت مجهر تشريح. يتم وصف استخدام صبغة التتبع لتسهيل مراقبة دقة الحقن في الوقت الفعلي. يتم توفير الرسوم التوضيحية للحقن الناجحة والفاشلة. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن إجراء حقن العصب المبهم المباشر بطريقة آمنة يتحملها الفئران جيدا دون مضاعفات ما بعد الولادة. على سبيل المثال ، بمجرد تدريب الجراحين على هذه الطريقة ، تم حقن ستة من أصل ستة فئران بنجاح دون أي مضاعفات. هذه الطريقة للحقن المباشر للأعصاب لدراسات الفئران قبل السريرية قادرة على توصيل العوامل (بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر العلاج الجيني) إلى الأعصاب الطرفية.

Introduction

يعد تطبيق الطريقة الصحيحة لإعطاء الدواء أحد العوامل الحاسمة في تحقيق نتائج علاجية ناجحة. على الرغم من وفرة طرق توصيل العامل العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، إلا أنه تم الإبلاغ عن طرق قليلة فقط لتوصيل الجهاز العصبي المحيطي (PNS) عن طريق الحقن المباشر للأعصاب. تمت تجربة الحقن المباشر للأعصاب ، مثل الحقن في العقد الجذرية الظهرية (DRG) في الفئران ، في دراسات قبل السريرية لفهم أفضل لآليات الألم ، وسمية الدواء ، ونقل الجينات¹^،²^،³ ، وتطوير الطريقة العامة¹^،⁴. تشمل التقارير الإضافية عن الحقن المباشر للأعصاب حقن العصب الشوكي⁴ ، وحقن العصب الوركي¹ ، وحقن العصب المبهم في الفئران⁵ والفئران⁶. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح طريقة للحقن فوق الغضروفي لتوزيع أفضل للعلاجات في رأس العصب البصري في الأرانب⁷.

يعتبر DRG الموقع المثالي للحقن المباشر للنواقل المحملة بالجينات المعدلة وراثيا مثل الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) بسبب الوظيفة الحسية لأجسام الخلايا في DRG². تم وصف كل من الطرق الجراحية وغير الجراحية لحقن DRG¹^،⁸. ومع ذلك ، فقد تم العثور على استنتاجات مثيرة للجدل حول اتساق النتائج مع الطريقة غير الجراحية لحقن DRG¹. تم اقتراح أن الطريقة الجراحية التي تنطوي على استئصال الصفيحة الفقرية الجزئية ناجحة بنسبة 100٪ لحقن DRG في الفئران دون أي تغيير في نتائج السلوك³ ، بالإضافة إلى طريقة تنطوي على قطع العظم الجزئي في الفئران⁹. تشير العديد من الدراسات إلى طرق حقن DRG لتوصيل الأدوية ، والتي تم استخدامها في أبحاث العلاج الجيني قبل السريري في الفئران^{والفئران 1}^،²^،¹⁰. قد تتضمن دراسات العلاج الجيني القائم على النواقل التي تتضمن الحقن الموضعي الفوائد التالية: انخفاض التعبير خارج الهدف ، وتقليل السمية الجهازية ، وتقليل الأحمال الفيروسية وأحجام الحقن ، وانخفاض خطر حدوث مضاعفات مناعية¹¹ ^، ¹².

تمت تجربة طريقة الحقن المباشر في العصب الوركي ، وهو أطول عصب في الجسم ، عن طريق تعريض العصب الوركي الأيمن عند مستوى منتصف الفخذ للفئران. استخدمت الطريقة ماصة زجاجية مسحوبة مزودة بنظام حقن يتم التحكم فيه بواسطة المعالجة الدقيقة لحقن حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر صبغة بمعدل تدفق 1.2 ميكرولتر / دقيقة¹. أظهرت هذه التجربة نقصا في توزيع الصبغة على مستوى DRG ، وكان التوزيع محدودا في الغالب حول موقع الحقن. وبالمثل ، تم تجربة طرق أخرى لحقن الأعصاب المباشرة ، مثل حقن العصب الشوكي ، بالصبغة لتقييم الكمية المناسبة من حجم الحقن ونمط توزيع الصبغة في الفئران. يقترح أن يكون 2 ميكرولتر مثاليا لحقن العصب الشوكي ، بينما أظهر 3 ميكرولتر من الصبغة عن طريق حقن DRG التوزيع في كل من العقد الجذرية الظهرية والبطنية في الفئران¹. تم الإبلاغ عن أن حجم حقن DRG في الفئران هو الأمثل من 1.0 ميكرولتر إلى 1.5 ميكرولتر بناء على السلالة وحجم الجسم²^،⁹.

تم استخدام طريقة حقن العصب المبهم المباشر في الفئران⁵ والفئران⁶ لتقييم دور الإصابة العصبية أو السلامة الخلوية في نقل α السينوكلين البشري. تصف هاتان الدراستان ، اللتان أجرتهما نفس المجموعة من الباحثين ، طريقة موجزة لحقن ناقلات AAV مباشرة في العصب المبهم الأيسر في منطقة عنق الرحم. في الفئران ، تضمنت الطريقة شعيرات دموية زجاجية بقطر طرف 60 ميكرومتر لحقن ناقل 2 ميكرولتر بمعدل تدفق 0.5 ميكرولتر / دقيقة مع حقنة هاميلتون 5 ميكرولتر. في الفئران ، تم حقن حجم إجمالي قدره 750 نانولتر محلول ناقل بمعدل تدفق 160 نانولتر / دقيقة باستخدام إبرة فولاذية حادة 36 جم مثبتة على حقنة NanoFil سعة 10 ميكرولتر⁶. أظهرت هذه التجارب أن الجين المعدل تم تسليمه والتعبير عنه في محاور عصبية في الجسر والدماغ المتوسط للجرذان والفئران. وبالمثل ، أظهرت النواة الحركية الظهرية للعصب المبهم الأيسر تفاعلا مناعيا إيجابيا مع الجينات المعدلة وراثيا. توضح هذه الأدلة أن طريقة حقن العصب المبهم المباشر قد تكون طريقة موثوقة في العلاج الجيني حيث يمتد التنبيغ الخلوي إلى عدة مواقع من الدماغ ، والتي تعرض المحاور من خلال العصب المبهم. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تذكر استخدام أي صبغة لتتبع دقة الحقن.

هنا ، يتم وصف طريقة للحقن المباشر في العصب المبهم الأيسر باستخدام أصباغ تتبع غير سامة قابلة للتطبيق إلى حد كبير على الباحثين في الدراسات قبل السريرية. وتناقش المزالق المحتملة التي قد تسبب صعوبات في إيصال الدواء وسبل التغلب عليها. يتم توضيح هذه المواقف بالصور لإظهار ما الذي يجعل التسليم غير ناجح وطريقة إنجاحه.

Protocol

يتم إجراء البروتوكول التالي وفقا لإرشادات الأخلاقيات المؤسسية وموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC).

1. إعداد السكن

ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للفئران البالغة التي لا تقل أعمارها عن شهرين. الصغيرة (بما في ذلك الفئران والجرذان الأصغر سنا) ممكنة ولكن لا ينصح بها وستكون أكثر صعوبة.

قدم طعاما رطبا أو أي طعام طري آخر (جل التعافي البيطري) لمدة 48 ساعة قبل جراحة العصب المبهم. نظرا لأن قد تواجه صعوبة في تناول الطعام بعد العملية ، فقم بإدخال هذه العناصر للحيوانات قبل الجراحة لمساعدتها على التعرف على مذاق هذه العناصر وتحفيز الدافع على تناول الطعام.
الفئران البيوية بشكل فردي في قفص على الأقل 1 قبل الجراحة ، وكذلك أسبوع واحد بعد الجراحة. سيمكنهم ذلك من التأقلم مع ضغوط البقاء بمفردهم ومنع خدش الجروح بعد الجراحة من قبل زميل القمامة.

2. تحضير العناصر الجراحية والمساحة

قم بعمل قائمة بجميع العناصر الضرورية في وقت مبكر وتحقق جيدا من توفر جميع العناصر للجراحة.
تعقيم جميع العناصر بطرق التعقيم المناسبة قبل الجراحة.
قم بإعداد المساحة الجراحية المعقمة تحت المجهر التشريح. ضع وسادة تدفئة تحت المجهر للحفاظ على دفء الجرذ أثناء الجراحة.
ضع جميع المواد الجراحية على طاولة جراحية على ستارة معقمة. احتفظ بمساحة كافية للجراحة تحت مجهر التشريح. تأكد من أن تركيز المجهر هو الأمثل ويشمل المنطقة الجراحية لتصور العصب.
ضع مضخة الحقنة بالقرب من المرحلة الجراحية بحيث يكون طول الأنبوب كافيا للوصول إلى موقع الحقن.
ضع الأدوات الجراحية باتجاه جانب يد الجراح المهيمنة.

3. تحضير خليط من الدواء المرشح وصبغة التتبع

تأكد من تخفيف الدواء المرشح لتحقيق التركيز المطلوب في المخفف الموصى به بحيث يعطي 5 ميكرولتر من الدواء الممزوج بالصبغة الكمية المطلوبة من الدواء المرشح المراد توصيله. يوصى بالحد الأقصى لحجم الحقن بطريقة العصب المبهم المباشر ب 5 ميكرولتر (بما في ذلك صبغة التتبع ، انظر الخطوة 3.2).
امزج صبغة متوافقة مع الدواء المرشح لتمكين تتبع دقة الحقن في الوقت الفعلي. على سبيل المثال ، التركيز النهائي إما 1٪ Luxol Fast Blue أو 0.002٪ فلورسين هي أصباغ متوافقة للاستخدام.
تنبيه: استخدم الصبغة بتركيزها الأمثل في خليط الصبغة والأدوية المرشحة. عندما يكون تركيز الصبغة في الخليط منخفضا جدا ، فقد لا يكون من المرئي تتبع الحقن. عندما يكون تركيز الصبغة مرتفعا جدا ، فقد ينتج عنه خليط سميك جدا ولزوجة عالية ، مما يؤدي إلى سد إبرة الحقن.

4. تحميل خليط الدواء والصبغة المرشح في الأنبوب

قم بتوصيل حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر مع إزالة المكبس بإبرة 27 جراما.
قم بتوصيل أحد طرفي ما يقرب من 45 سم من أنابيب البولي إيثيلين المعقمة بإبرة 27 G.
خذ حقنة بلاستيكية سعة 3 مل وقم بتثبيتها بإبرة 27 جراما. قم بتحميل المحقنة بحوالي 0.5 مل من محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪.
املأ أنبوب البوليثين بالمحلول الملحي العادي بنسبة 0.9٪ من الطرف المفتوح لملء الطول الكامل للأنبوب وبرميل المحقنة الزجاجية بالكامل حتى يفيض للخارج.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب احتجاز فقاعات الهواء داخل الأنبوب.
قم بإزالة وتخلص من المحقنة والإبرة سعة 3 مل.
أدخل مكبس المحقنة في برميل المحقنة الزجاجية وادفعه للأمام قليلا حتى منتصف البرميل.
ضع المحقنة الزجاجية في مضخة المحقنة.
اسحب المكبس للخلف قليلا باستخدام مضخة الحقنة لإنشاء مساحة هوائية تبلغ حوالي 1.5 سم في الطرف المفتوح بطول الأنبوب.
ماصة ما لا يقل عن 5 ميكرولتر من الصبغة وخليط الدواء المرشح مع ماصة دقيقة سعة 10 ميكرولتر وإسقاطها على قطعة معقمة من البارافيلم
اسحب خليط الدواء المرشح إلى الأنبوب عن طريق سحب المكبس للخلف عبر مضخة المحاقنة. حافظ على فقاعة الهواء بين محلول ملحي بنسبة 0.9٪ ومحلول الحقن ، ولكن بخلاف ذلك ، تجنب حبس أي فقاعات هواء داخل محلول الحقن. ضع علامة على مستوى خليط الحقن في الأنبوب بعلامة.
ملاحظة: تعد فجوة الهواء بين خليط صبغة الدواء المرشح والمحلول الملحي المعقم داخل الأنبوب أمرا بالغ الأهمية لمنع خلط المحلولين.
تناسب الإبرة 35 جم مع الأنبوب. ثبت الإبرة على السطح النظيف للمرحلة الجراحية بشريط لاصق حتى لا تكون الإبرة فضفاضة ولا تتحرك وتلمس أي شيء آخر وتظل معقمة.

5. فتيلة إبرة الحقن

اضبط برنامج مضخة الحقنة على توزيع 0.5 ميكرولتر / دقيقة.
ابدأ مضخة الحقنة لمدة 10-15 ثانية ، حتى يبدأ محلول الحقن في الخروج من طرف الإبرة. تشير كمية صغيرة من الخليط عند طرف الإبرة دون تسرب في مفصل الأنبوب وإبرة الحقن (أو في أي مكان آخر على طول المحقنة أو الأنبوب أو الإبرة) إلى أن الإعداد صحيح.
ملاحظة: إذا لم تظهر قطرة صغيرة عند طرف الإبرة ، فهذا يشير إلى انسداد الإبرة. قد يحدث انسداد الإبرة بسبب اللزوجة العالية للدواء المرشح وخليط الصبغة ، والهواء الزائد المحبوس داخل النظام ، وعدم وضع المحقنة الزجاجية بشكل صحيح داخل مضخة الحقنة. انظر الشكل 1 للحصول على مثال على التسرب عند التقاطع بين الإبرة والأنبوب. يعد التحضير أمرا بالغ الأهمية لأنه يساعد على تحديد ما إذا كانت الإبرة خالية من العوائق وأن الحقن داخل العصب سيمر بسلاسة.

6. تحضير الفئران للجراحة

الحصول على وزن جسم الجرذ لحساب الجرعة اللازمة من المسكنات. على سبيل المثال ، يستخدم الكاربروفين بمعدل جرعة 5 مجم / كجم تحت الجلد في الفئران.
ملاحظة: يوصى بتخزين الكاربروفين في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الحقن.
قم بتخدير الجرذ باستخدام مبخر الأيزوفلوران باستخدام معدل تدفق 3٪ -4٪ لتحريض التخدير لمدة 2-3 دقائق. تقليل معدل تدفق الأيزوفلوران إلى حوالي 1.75٪ -2٪ للحفاظ على التخدير.
انقل الجرذ إلى طاولة منفصلة مع إعداد لإزالة الشعر وإعداد الموقع. تأكد من أن هذا الجدول قريب من مساحة الجراحة.
ضع مرهما اصطناعيا للدموع في كلتا عيني الفئران لمنع الجفاف المفرط.
قم بإدارة المسكنات وفقا لبروتوكول المؤسسي المعتمد للسيطرة على الألم عند عودة الجرذ إلى الوعي.
حلق المنطقة الجراحية باستخدام ماكينة قص الشعر في الجانب البطني من الرقبة في منطقة عنق الرحم. حلق مسافة تصل إلى حوالي 2 سم عموديا من خط الوسط على كلا الجانبين من الذقن إلى القص.
تعقيم المنطقة ب 70٪ كحول إيثيلي و 10٪ بيتادين ، وامسح المنطقة ثلاث مرات بالتناوب باستخدام مسحة كحولية وبوفيدون يود. امسح من وسط المنطقة إلى الخارج بنمط دائري.
انقل الفئران إلى المرحلة الجراحية تحت المجهر في وضع ضعيف. اضبط تركيز المجهر لتصور منطقة الجراحة في منطقة عنق الرحم.

7. إجراء جراحة الفئران لحقن الدواء المرشح مباشرة في العصب المبهم الأيسر (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4)

ملاحظة: سيتطلب هذا الجزء من الطريقة شخصا ثانيا لمساعدة الجراح.

ضع الجرذ على وسادة تسخين في وضع ضعيف تحت مجهر التشريح المرتبط بضوء مركب.
اربط أسنان الفك العلوي الأمامي للفأر بقطعة من الخيط غير القابل للامتصاص وقم بتثبيت الطرف المفتوح للخياطة داخل مخروط الأنف بحيث يكون فتحة الأنف دائما داخل مخروط الأنف طوال فترة التخدير.
ضع الجرذ بحيث يقع رأسه على الجانب الأيسر من الجراح الأيمن (أو الجانب الأيمن من الجراح الأيسر). في هذا الوضع ، يكون الجانب الأمامي للجراح عموديا على جسم الفئران. ضع وسادة من المقياس المعقم تحت الرقبة واضبط زاوية منطقة عنق الرحم للفأر بحيث تصبح منطقة عنق الرحم مستقيمة. سيسهل ذلك تحديد موقع العصب المبهم الأيسر وإجراء الحقن.
ثنى جسم الجرذ بالكامل بستارة معقمة ، مع إبقاء مساحة الجراحة مفتوحة.
قم بإصلاح أربعة دبابيس ضام بشكل فردي باستخدام 4 مثبتات مغناطيسية مع اللدائن وضع المثبتات في الزوايا الأربع للمرحلة الجراحية.
حقن التخدير الموضعي في الجلد في خط الوسط لمنطقة عنق الرحم حيث يتم إجراء الشق. على سبيل المثال ، عادة ما يتم استخدام مزيج من الليدوكائين والبوبيفاكين.
قم بعمل شق جلدي طولي بطول 2 سم عند خط الوسط بين الذقن والقص بشفرة مشرط في الجانب البطني من الرقبة في منطقة عنق الرحم (الشكل 3 أ).
افصل الحواف المقطوعة للجلد بأطراف قطنية معقمة.
اسحب حواف الجلد في اتجاهين متعاكسين من موقع الشق بمساعدة أطراف الضام.
افصل الواجهة بأطراف قطنية للتعمق أكثر. ادفع الغدد اللعابية نحو الجانب الجانبي.
افصل عضلات القص بأطراف قطنية واسحبها جانبا باستخدام المسامير. مع تقدم انفصال العضلات القصية على نطاق واسع ، تظهر القصبة الهوائية في المنتصف ، مغطاة بالعضلة القصية (الشكل 3 ب).
ملاحظة: احرص على عدم الضغط على القصبة الهوائية.
تقدم في فصل الأنسجة على الجانب الأيسر من القصبة الهوائية للفئران حتى يظهر غمد الشريان السباتي ، والذي يحتوي على الشريان السباتي المشترك الذي يمتد مع العصب المبهم الأيسر.
قم بعمل ثقب صغير في غمد الشريان السباتي بعناية باستخدام ملقط ناعم ، مع الانتباه حتى لا تصيب الشريان السباتي تحت المجهر. افصل العصب المبهم الأيسر عن الشريان السباتي المشترك باستخدام ملقط دقيق.
ملاحظة: المنطقة الجراحية حرجة من الناحية التشريحية. جدار الشريان السباتي سميك وزلق ولا يصاب بسهولة ، لكن الطرف الحاد من الملقط الناعم قد يصيبه ، وقد يحدث نزيف. في الوقت نفسه ، انتبه حتى لا تؤذي العصب.
بمجرد فصل العصب عن الشريان بواسطة الملقط ، استخدم إبرة منحنية 25 جم مثبتة على حقنة 1 مل من تلك الفتحة إلى "الخطاف" وإمساك العصب باليد غير المهيمنة (الشكل 4 أ).
ملاحظة: يكون طرف الإبرة المنحنية غير حاد حتى لا يؤذي العصب والشرايان. يتم تصنيع زاوية انحناء طرف الإبرة حسب الطلب إلى حوالي 90 درجة باستخدام hemostat (الشكل 2).
باستخدام اليد المهيمنة ، أمسك الإبرة المحملة بخليط صبغة الأدوية المرشح وخز العصب برفق في نفس الاتجاه الذي يعمل فيه العصب بحيث يكون شطبة الإبرة متجها لأعلى.
1. لسهولة الوخز ، حافظ على استقامة العصب عن طريق السحب برفق باستخدام خطاف 25 جيجا. أدخل الإبرة في العصب وتقدم للأمام ، أكثر من 0.5 سم ، مع الحفاظ على الإبرة موازية للعصب المبهم. ثم اسحب للخلف قليلا بحيث تبقى إبرة حوالي 0.4-0.5 سم داخل العصب.
  ملاحظة: يجب أن تكون زاوية الإبرة ضحلة بما يكفي لاختراق العصب دون المرور إلى الجانب الآخر.
قد تكون هناك حالات تكون فيها الإبرة غير عائق خارج العصب في وقت التحضير ، لكن خليط صبغة الدواء المرشح لا يمر بسلاسة داخل العصب. لتجنب هذا الموقف ، قلل من عدد وخز الأعصاب بإبرة واحدة لا تزيد عن 3 مرات. إذا كانت الإبرة ضعيفة ، فستزداد فرص الانسداد أو الحقن الضعيف.
تأكد من أن الإبرة داخل العصب بالكامل. احتفظ بالوضع غير المتحرك وقم بتشغيل مضخة المحقنة.
ملاحظة: تحقق بعناية في موقع الحقن للتأكد من أن خليط صبغة الدواء المرشح لا يتدفق مرة أخرى من العصب.
أثناء الحقن ، افحص باستمرار أن التسريب يبقى داخل العصب ويتدفق بسلاسة. استخدم العلامة الموجودة على أنبوب التسريب لمراقبة حركة خليط صبغة الدواء من نقطة البداية.
1. إذا كان خليط صبغة الدواء المرشح لا يتدفق بسلاسة ، اسحب الإبرة للخارج وكرر خطوة التحضير (الخطوة 5.2). ثم أعد إدخال الإبرة في العصب واستأنف التسريب.
يبدأ العصب في تطوير لون الصبغة (الشكل 4 ب). استمر في التسريب عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة لمدة 10 دقائق لنقع كل 5 ميكرولتر من خليط صبغة الدواء المرشح.
ملاحظة: يوصى بري الأنسجة المكشوفة بكمية صغيرة من محلول ملحي معقم دافئ بنسبة 0.9٪ حسب الحاجة لمنع الجفاف المفرط والتلف.
بعد حقن 5 ميكرولتر وتوقف مضخة الحقنة ، احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 1 دقيقة إضافية للسماح لكل خليط صبغة الدواء المرشح بالانتشار من موقع الحقن. إزالة الإبرة.
قم بإزالة الإبرة المنحنية 25 جم. استخدم أطراف قطنية معقمة لتحريك المناديل برفق إلى موقعها الأصلي. قم بإزالة أطراف الضام.
أغلق الجرح بخياطة غير قابلة للامتصاص (يمكن أيضا استخدام خياطة قابلة للامتصاص). ضع كمية صغيرة من غراء الأنسجة بين الغرز إذا لزم الأمر لإغلاق الجرح تماما.

8. رعاية ما بعد الجراحة للفئران

نقع حوالي 3 مل من محلول ملحي دافئ 0.9٪ تحت الجلد بعد إغلاق الجرح. هذا يساعد الفئران على إعادة الترطيب على الفور.
ضع الجرذ في مصدر حرارة حتى يتعافى تماما من التخدير إلى الحالة الطبيعية. لاحظ أي شيء لوحظ غير طبيعي أثناء عملية الشفاء.
ملاحظة: قد تكون مدة الشفاء أطول إذا استغرق إجراء حقن العصب وقتا طويلا.
انقل الجرذ إلى قفص منزله مع طعام رطب على أرضية القفص. تأكد من توفر المياه طوال الوقت. راقب الجرذ بعد الجراحة لمدة ساعتين تقريبا للتأكد من أن الفئران لا تشعر بالبرد.
ملاحظة: ضع الجرذ في مصدر حرارة لساعات إضافية إذا شعرت بالبرد.
راقب الجرذ في 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الجراحة مع ملاحظات مكتوبة بالملاحظات. كرر المسكنات وفقا لبروتوكول المؤسسي المعتمد للسيطرة على الألم. على سبيل المثال ، يتم إعطاء جرعات الكاربروفين بمعدل 5 مجم / كجم تحت الجلد مرتين بفاصل 24 ساعة. استشر طبيبا بيطريا إذا بقي الألم في الفئران لأكثر من 48 ساعة.
كرر الحقن تحت الجلد بحوالي 3 مل 0.9٪ محلول ملحي دافئ في 24 ساعة بناء على ظروف الفئران.
استمر في تقييم الجرح. تأكد من جفاف الجرح وأنه في طور الشفاء.
ملاحظة: يمكن أن يكون احمرار وتورم وحالة الألم للجرح مع خمول وبهتان الفئران مؤشرا على التهاب الجرح وقد يستدعي استشارة بيطرية إضافية. سيظهر الجرذ المصاب بالألم ظهرا منحنيا ومعطفا مكشكشا وعيون حمراء وحالة غير نشطة. توجد عادة في زاوية من القفص.
قم بإزالة الغرز غير القابلة للامتصاص في غضون أسبوعين بمجرد التئام الجرح.

النتائج

تم استخدام ستة فئران بالغة (3 ذكور و 3 إناث) في هذه الدراسة. من بين ستة ، تم حقن فأر واحد عدة مرات لإثبات حالة فشل الحقن التي تظهر انتشار الصبغة حول موقع الحقن الشكل 5 أ. أظهرت جميع الفئران الأخرى حقنا سلسا وتلطيخا للأعصاب ، كما هو موضح في

Discussion

يمكن إجراء طريقة الحقن المباشر في العصب المبهم الأيسر بأمان وبدون مضاعفات ما بعد الجراحة في الفئران. يمكن استخدام توصيل الدواء إلى العصب المبهم لاستهداف الجهاز العصبي اللاإرادي (ANS). يتضمن ذلك بعض الخطوات الحاسمة التي تتطلب ممارسة ودرجة متوسطة إلى عالية من المهارة الجرا...

Disclosures

المؤلفان NR و XC ليس لديهما تضارب في المصالح. RMB و SJG مخترعان للملكية الفكرية المتعلقة بنقل الجينات إلى ANS عن طريق حقن العصب المبهم (براءة اختراع الولايات المتحدة # 11،753،655). حصلت SJG و RMB على دخل من الإتاوات من Taysha Gene Therapies ، وحصلت SJG على دخل استشاري من Taysha Gene Therapies.

Acknowledgements

نود أن نشكر مرفق مركز موارد الجنوبي الغربي في UT لترتيب مساحة جراحية للفئران. تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المصادر التالية ل SJG: NIH / NINDS R01 NS087175 ، وصندوق Hannah's Hope Fund ، و Taysha Gene Therapies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Tuberculin Syringe with Detachable 25 G x 5/8". Needle	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Used to connect with curved needle to pull the vagus nerve and hold it at the time of injection.
0.5% Bupivacaine Hydrochloride Injection	Hospira	NDC 0409-1162-19	Local anesthetics used to anesthetize local tissue.
100 mL 0.9% Sodium Chloride Irrigation USP	Stericare Solutions	Item #6240	Normal saline, used to rehydrate rat and tissue.
20 Blunt, Retractor Tips, 7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Used to pull apart and hold tissues at the time of surgery.
3 mL BD-Luer-Lok Syringe, Sterile, Single Use	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Used to inject saline in rat and fill the saline into the Polythene tubing.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein dye visible within the nerve. Used to track injection fidelity.
Animal Weighing Scale	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Used to measure body weight of rat.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Surgical Gloves	Ansell	ASTM D3577	Sterilie glove, it is used at the time of surgery by a surgeon.
Artificial Tears Ointment 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Used in eyses to prevent excessive dryness of eyes.
Baby-Myxter Hemostat	Fine Science Tools	13013-14	Used to stop bleeding in case of emergency. Also used to bend the 25 G x 5/8" in needle.
BD Intramedic PE Tubing	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Used in the injection set up system to connect with Hamilton needle and NanoFil Needles. It also holds the injection mixture.
BD Precison Glide Needle, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Used to inject saline in rat, and to make a curved needle.
BD Precison Glide Needle, 27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Used to fill sterile saline into the BD Intradermic tubing.
Benchmark Accuris ”NextPette” Variable Volume Pipette Micro Starter Setincludes 4 pipettes: 10/20/200/1000 μL, plus stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Used to pippette sterile solution.
Betadine, Povidine Iodine 10%	Honestmed	67618015017	Used to disinfect the surgical area.
Carprofen Injectable solution 50 mg/mL	Supplied by Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In our case, we used diluted carprofen at the dose rate of 5 mg/kg provided by the Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Curved needle (custom made)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in needle is curved to 90 degrees with the help of a hemostat. The tip of the needle is made blunt. It needs to be sterilized before use. It is used to hook the vagus nerve and hold it at the time of separation and injection.
Dissecting microscope	Motic	SMZ-171-BLED (Binocular with Lights)	Used to magnify the crifical anatomical area at the time of vagus nerve separation, injeciton, and to check injection leakage.
Drape sheet	Dynarex	Reorder#8122	Used as drape after sterilization.
Dukal Cotton Tip Applicators, Non-Sterile	Dukal	Item 9003	Used to blunt separation of tissue, needs to sterilize before use.
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20	Used to separate the left vagus nerve from common carotid artery. It is curved so easy to use.
Ethicon PDS II Undyed Monofilament Suture - SUTURE, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Used in suturing the wound.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Used in suturing the wound if non-absorbale suture is used. Also used to hook the rat tooth to fix nose inside the nose cone.
Fine Forceps - Mirror Finish	Fine Science Tools	11412-11	Used at the time of vagus nerve separation from the common carotid artery. This is straight.
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Ued to cut tissue.
Hamilton cleaning solution	Hamilton	HT18311	Used to clean the Hamilton after use.
Hamilton Needle, 27G, Small Hub RN Needle, 2”, PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Used to connect BD Intramedic™ PE Tubing.
Hamilton Syringe , 710RN	Hamilton	7638-01	Used to hold drug at the time of vagus nerve injection.
Insulin Syringe	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Used to inject carprofen and local anesthetics.
Lidocaine 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Used to mix with Bupivacaine and inject at the site of incision.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Dye visible within the nerve, used to mix with drug so that injection mixture is visible.
Micro Bead Sterilizer with Glass Beads	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	Used to sterilize surgical tools in between the rat surgery.
NanoFil Needles-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Used to inject drug - dye mixture inside the vagus nerve.
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-12	Used in wound suturing.
Parafilm M Laboratory Wrapping Film, 4 Inches x 125 Feet, 1 Roll per Box, 12 Count	Honestmed	PM#996	Used to hold the aliquoted 5 uL of drug-dye mixture so that loading of drug-dye mixture into the BD^TM intradermic tubing is accurate.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Used to disinfect the surgical area.
Premium Care Sterile Type VII Gauze Sponges, 8-Ply, 2" x 2"	Dukal	Item C5119	Used as cushon under the neck of rat at the time of surgery.
Press’n Seal Cling Film	Glad		Used to cover a rat at the time of surgery like a drape.
Rat Retractor Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Used to keep the incision open so that it is easy to separate the vagus nerve from the carotid artery.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm W x 25.4 cm L (8 in W x 10 in L), used to keep rat warm.
S&T Forceps - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Used at the time of suturing to hold tissue without damage.
S&T Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13	Used to tight the suture.
Scalpel blade #15	Fine Science Tools	10015-00	Used to make an incision in the skin at the ventral side of neck.
Scalpel Handle-#7	Fine Science Tools	10007-12	Used to hold the scalpel blade.
Syringe Pump	KD Scientific	78-81-8052GL	Serial #D107034, Model#LEGATO-180, is a programmable pump that can pump small volume of mixture under a program.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Item #1120-3510	Used to pipette the drug and dye mixture.
Vaporizer for Isoflurane, Funnel Filled	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Used to anesthetize rats.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Used to seal tissue at the site of cut wound if suturing is not perfect.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Used to cut hair of rat.

References

Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
O'donnell, M., Fontaine, A., Caldwell, J., Weir, R. Direct dorsal root ganglia (drg) injection in mice for analysis of adeno-associated viral (AAV) gene transfer to peripheral somatosensory neurons. J Neurosci Methods. 411, 110268 (2024).
Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
Rueter, L. E., Kohlhaas, K. L., Curzon, P., Surowy, C. S., Meyer, M. D. Peripheral and central sites of action for a-85380 in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. Pain. 103 (3), 269-276 (2003).
Ulusoy, A., et al. Neuron-to-neuron alpha-synuclein propagation in vivo is independent of neuronal injury. Acta Neuropathol Commun. 3, 13 (2015).
Helwig, M., et al. Brain propagation of transduced alpha-synuclein involves non-fibrillar protein species and is enhanced in alpha-synuclein null mice. Brain. 139 (Pt 3), 856-870 (2016).
Chiang, B., et al. Development of a novel suprachoroidal-to-optic-nerve (scone) drug delivery system. Drug Deliv. 31 (1), 2379369 (2024).
Ferrari, L. F., Cunha, F. Q., Parada, C. A., Ferreira, S. H. A novel technique to perform direct intraganglionar injections in rats. J Neurosci Methods. 159 (2), 236-243 (2007).
Yuan, X. M., et al. Rapid injection of lumbar dorsal root ganglia under direct vision: Relevant anatomy, protocol, and behaviors. Front. Neurol. 14, 1138933 (2023).
Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer. BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).
Ertl, H. C. J. Immunogenicity and toxicity of AAV gene therapy. Front Immunol. 13, 975803 (2022).
Wayman, C., et al. Performing permanent distal middle cerebral with common carotid artery occlusion in aged rats to study cortical ischemia with sustained disability. J Vis Exp. (108), e53106 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: