في مختبر مورهاردت ، نستخدم سمك الزرد كنموذج حيواني لدراسة نمو المثانة ووظيفتها. لقد حددنا مثانة بولية وظيفية تملأ وتفرغ في الزرد. في حين أن أسماك الزرد صغيرة ، فقد سعينا للاستفادة من حجمها للاستفادة اقتصاديا من تقنيات النسخ المكاني وفهمنا لمثانة الفقاريات.
يمكن أن تصبح تقنيات النسخ المكاني باهظة الثمن بسرعة إذا لم يتم تحسين الكواشف والمعدات. يوفر هذا البروتوكول تقنية مثبتة لتحقيق ذلك باستخدام أسماك الزرد ويوفر رؤى حول النتائج المتوقعة والتخفيف من المشكلات التي قد تنشأ نتيجة للتكنولوجيا. إلى جانب الاستخدام الاقتصادي لتقنيات النسخ المكاني باهظة الثمن ، سمح لنا هذا العمل بإجراء تحليلات نسخية مكانية واسعة النطاق لأعضاء كاملة بشكل أساسي عبر عدة عصور مع تقليل تأثيرات الدفعات.
للبدء ، قم بتبريد ناظم البرد إلى 22 درجة مئوية واجمع كل العناصر المطلوبة. قم بإعداد قالب بلاستيكي يمكن التخلص منه لمحاذاة العينة. ضع قطعة من شريط المختبر داخل قالب القاعدة وارسم خطا مستقيما عبره بعلامة دائمة كنقطة مرجعية.
ضع علامة على الجزء الداخلي من قالب القاعدة لضمان اتجاه العينة المناسب أثناء التقطيع بالتبريد. بعد تحضير فوهة الزجاجة المتوسطة للتجميد ، قم بتوزيع الكمية اللازمة في أحد أركان القالب الأساسي. قم بإمالة القالب الأساسي ببطء لتوزيع الوسط بالتساوي.
الآن ، ضع القالب الأساسي بوسط تجميد في حمام جليدي واحتضنه لمدة 10 دقائق على الأقل لتبريد الوسط. بعد ذلك ، أضف جزءا واحدا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى جزء واحد من الثلج الجاف في دلو ثلج تحت غطاء الدخان. ضع طبق أو قارب الألمنيوم القابل للتصرف في الحمام الجليدي وقم بتغطية الدلو لمدة خمس إلى 10 دقائق.
اجمع الأسماك الرحيم بعد غمرها في ماء أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. باستخدام ملقط ناعم الرؤوس ، أمسك الزعنفة الذيلية لإزالة السمكة واضغط عليها برفق على منديل ماص خال من النسالة لتجفيفه. ضع قالب القاعدة المحضر تحت مجهر استريو بتكبير 10x.
ضع العينة في القالب على طول النقطة المرجعية في الاتجاه الصحيح. قم بتغطية العينة برفق بطبقة رقيقة أخرى من وسط التجميد. استخدم نقطة مرجعية تشريحية لمحاذاة السمكة بدقة مع الخطوط المحددة داخل قالب القاعدة وضبط الاتجاه باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، وتجنب الفقاعات.
ضع قطعة من الثلج الجاف في قاع قالب القاعدة أسفل العينة حتى يتم تجميدها محليا في موضعها. حافظ على مستوى أفقي مستو لمنع اختلال محاذاة العينة قبل التجميد تماما. الآن ضع القالب الأساسي مع العينة على قارب أو طبق من الألومنيوم في حمام الثلج الجاف والإيثانول.
تأكد من بقاء القارب عائما على السطح وأن القالب الأساسي يظل جافا. غطي الحمام واتركي العينات تتجمد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، لف القالب الأساسي المجمد بورق القصدير واحفظه في الفريزر على حرارة 80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتقسيم.
أحضر قالب القاعدة المجمد إلى ناظم البرد المبرد مسبقا للتقطيع بالتبريد وضعه في حجرة ناظم البرد. بعد إزالة شريحة التصوير المكاني من التخزين ، ضعها في حامل شرائح مبرد مسبقا. قم بتخزين حامل الشريحة مع شريحة التصوير المكاني في حجرة ناظم التبريد 22 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لتجميع القسم.
الآن ، قم بإزالة العينة المجمدة من القالب الأساسي وضعها في ظرف به وسط تجميد جديد ، مع التأكد من أن سطح القطع يواجه الشفرة الدقيقة. ثم ضع شفرة ميكروتومي دقيقة جديدة في ناظم البرد. بعد محاذاة القالب مع الشفرة ، قم بقص منطقة الاهتمام بسماكة موصى بها من 20 إلى 50 ميكرومتر.
تأكد من نقل العلامات داخل القالب إلى الكتلة المجمدة لتوجيه العينة بشكل صحيح. اضبط القالب أثناء التشذيب بحيث يظل سطح القطع موازيا للعلامات المرجعية في وسط التجميد. قم بتقطيع أقسام من الكتلة المجمدة واجمعها على شريحة مجهر قياسية موجبة الشحنة.
تحقق من الأقسام الموجودة أسفل مجهر المجال الساطع للتأكد من اكتمال التشذيب. ثم قم بإزالة شريحة التصوير المكاني من غرفة ناظم التبريد وضعها في حمام جليدي بأربع درجات مئوية ، مع الاحتفاظ بها داخل حامل الشريحة. ابدأ القطع بالتبريد بسماكة موصى بها من 10 إلى 14 ميكرومتر.
اجمع الأقسام على شرائح موجبة الشحنة حتى يتم الوصول إلى منطقة الاهتمام. الآن استرجع شريحة التصوير المكاني أحادية الخلية من الحمام الجليدي وقم بإزالة الشريحة من الحامل. اجمع المقاطع صفا تلو الآخر باستخدام فرشاة رسم دقيقة لمنع التدحرج.
ثم اضغط على زاوية من وسط التجميد الفارغ على مرحلة السكين باستخدام الجانب الخلفي من فرشاة الرسم. استخدم الجزء العلوي من الشريحة كنقطة محورية وقم بخفض الشريحة ببطء على القسم للسماح لها بالالتصاق لمدة ثلاث ثوان قبل رفعها. خطوط الأقسام التسلسلية المتوازية مع بعضها البعض لزيادة المساحة على الشريحة.
بعد جمع الأقسام من منطقة الاهتمام ، ضع الشريحة مرة أخرى في حامل الشريحة. إذا لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من العينات ، فقم بتخزين الشريحة على حرارة 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التحليل. اجمع الأقسام قبل وبعد منطقة الاهتمام على شريحة مجهر قياسية موجبة الشحنة وقم بتلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين لتقييم محاذاة العينة وجودة القسم قبل متابعة التحليل.
تم التحقق من محاذاة الأقسام المتعددة من خلال مقارنة الهياكل عبر الأقسام في نفس القطع. مكنت التعديلات على خطوات التضمين والتجميع عددا أكبر من الأقسام من الاحتواء لمنطقة التصوير لشريحة النسخ المكاني. كانت جودة إشارة النسخ المكاني عالية داخل مناطق الأنسجة ولكنها أقل في مناطق الشرائح الفارغة بسبب انخفاض تعقيد الإشارة.
