مناهج البيولوجيا الهيكلية والكيمياء التحليلية لتوصيف إنزيمات التمثيل الغذائي C-glycoside في ميكروبات الأمعاء البشرية. بروتوكول. الأول ، إنتاج البروتين وتنقيته. بناء متجه التعبير.
احصل على تسلسل مجموعة الجينات GenBank LC422372.1 من NCBI. استنساخ الجينات في ناقل pET-28a معدل. تحويل البلازميدات إلى خلايا مختصة بالإشريكية القولونية BL21 DE3.
بعد ذلك زراعة البكتيريا في LB وسط مع 50 ميكروغرام لكل مليلتر كاناميسين في 37 درجة. أضف 0.2 ملليمول IPTG إلى الوسط عندما تصل كثافة البكتيريا OD600 إلى 0.6. استزراع البكتيريا على حرارة 16 درجة لمدة 16 ساعة.
الطرد المركزي للثقافة البكتيرية عند 4 ، 000 مرة جم عند أربع درجات. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات البكتيرية. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في Buffer A.تنقية البروتين.
أضف ملليمول PMSF إلى إعادة التعليق البكتيري. قم بتحويل تعليق البكتيريا بواسطة قاطع الخلايا بالموجات فوق الصوتية. الطرد المركزي المحللة البكتيرية عند 48 ، 000 مرة جم لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات.
قم بتنقية البروتين الموجود في المادة الطافية باستخدام عمود NTA لكروماتوغرافيا تقارب النيكل. قم بتخطيب البروتين المرتبط باستخدام Buffer B في تدرج. اجمع العينات ذات الامتصاص العالي للأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر ونطاقات بروتين واضحة من SDS-PAGE للخطوة التالية.
غسيل العينات بالكفاية ضد Buffer C.قم بتنقية البروتين الذي تم تحلله باستخدام عمود كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. اربط البروتين المستهدف بالعمود باستخدام Buffer C.Elute البروتين المرتبط بمكون Buffer D. قم بتنقية البروتين باستخدام عمود استبعاد الحجم باستخدام Buffer E.Collect عينات البروتين للخطوة التالية.
ركز عينات البروتين إلى 20 ملليغرام لكل مليلتر ، وقم بتقطيعها ، وقم بتجميدها بسرعة بالنيتروجين السائل. قم بتخزينه على حرارة 80 درجة لاستخدامه في المستقبل. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام QuickDrop مع الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر.
ثنائي اللون الدائري ، القرص المضغوط ، جمع بيانات الطيف. خفف البروتينات إلى 0.2 ملليغرام لكل مليلتر في المخزن المؤقت PBS مرة واحدة ، الرقم الهيدروجيني 7.4. اضبط سرعة مسح الجهاز على 50 نانومتر في الدقيقة وعرض النطاق الترددي الطيفي على نانومتر واحد.
جمع البيانات الطيفية للقرص المضغوط في نطاق الطول الموجي من 200 إلى 260 نانومتر. اطرح خلفية PBS وخذ متوسط القيمة من ثلاثة قياسات. ثانيا ، علم البلورات البروتيني والتحديد المنظم.
نمو بلورات البروتين وتحسينه. قم بإجراء فحص التبلور الأولي بطريقة الجلوس والإسقاط باستخدام مجموعات تبلور البروتين على ألواح بلورية 48 بئرا. اضبط تدرجات تركيز الترسيب والبروتين لتحسين تبلور البروتين باستخدام طريقة الإسقاط المعلق.
انقل البلورات إلى محلول نقع يحتوي على مخزن مؤقت للخزان ومركبات مستهدفة عند 16 درجة لمدة 30 دقيقة بعد النمو الكامل. نقل البلورات إلى محلول بروسي بالتبريد يحتوي على مخزن مؤقت للتبلور مكمل بنسبة 25٪ من الجلسرين ويتم تخزينه على الفور في النيتروجين السائل لجمع البيانات. جمع البيانات والتحديد المنظم لبلورات البروتين.
اجمع المجموعة الكاملة من بيانات حيود الأشعة السينية عند خطوط شعاع SSRF ل NFPS باستخدام أطوال موجية ساحرة تبلغ 0.978 أنجستروم. معالجة بيانات حيود البلورات في البداية باستخدام برنامج معالجة البيانات البلورية للبرنامج. قم بتنفيذ المراحل باستخدام برنامج معالجة البيانات التلقائي.
استخدم برنامج تحديد الهيكل البلوري لتحسين نموذج الهيكل التلقائي وتحسينه. ثالثا ، مراقبة نشاط التفاعل وتحديد المعلمات الحركية. مراقبة نشاط DgpA / B / C بواسطة HPLC.
قم بتجميع نظام تفاعل الانقسام C-glycoside في المخزن المؤقت PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، الذي يحتوي على 20 ميكرومول لكل مليلتر DgpA / B / C ، واحد ملليمول لكل لتر من أيون المنغنيز ، ملليمول واحد لكل لتر NAD ، 10 ملليمول لكل لتر DTT ، و 0.1 ملليمول لكل لتر ركيزة ، puerarin ، daidzin ، genistin. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات وتحتضن على حرارة 37 درجة لمدة ثماني ساعات. أضف ثلاثة أضعاف كمية الميثانول إلى نظام التفاعل لإنهاء التفاعل.
الطرد المركزي محلول التفاعل عند 16 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الرواسب. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بإجراء تحليل HPLC مع شطف التدرج بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة ، وكشف الأطوال الموجية للأشعة فوق البنفسجية 265 نانومتر ، وحجم حقن 10 ميكرولتر.
مراقبة نشاط DgpA باستخدام 2 ، 6-ثنائي كلورو الفينول إندوفينول ، DCPIP ، الفحص. احتضان 0.8 ملليمول لكل لتر DCPIP ، و 50 ميكرومول لكل لتر بروتين ، و 10 ملليمول لكل لتر من الركيزة في المخزن المؤقت PBS مرة واحدة ، الرقم الهيدروجيني 7.4. بعد 20 ساعة من التفاعل ، سجل تغيير امتصاص DCPIP عند 600 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
تحديد معدل تثبيط الجلوكوز على تفاعل انقسام الرابطة الجليكوسيدية C للبويرارين. قم بإجراء التفاعل في المخزن المؤقت PBS مرة واحدة ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، بتركيزات مختلفة من الجلوكوز لنظام التفاعل كما هو موضح في القسم 3.1. قم بإجراء التفاعل عند 37 درجة لمدة 12 ساعة.
إجراء تحليل كمي للمنتجات التي تم إنشاؤها باستخدام HPLC. تحديد المعلمات الحركية. تم تعيين تركيز البويرارين من 0.01 إلى أربعة ملليمول لكل لتر ، وكان تركيز الديدزين والجينيستين من 0.01 إلى ملليمول لكل لتر في تفاعل انقسام جليكوسيد DgpA / B / C C.
قم بإجراء التفاعل عند 37 درجة لمدة ثماني ساعات وفقا للطريقة الموضحة في القسم 3.1. اشتقاق المعلمات الحركية Km و kcat عن طريق ملاءمة معدل التفاعل المحسوب وتركيز الركيزة لنموذج Michaelise-Menten في Prism. رابعا ، تحضير وكشف المنتج الوسيط للتفاعل.
تحضير منتج وسيط التفاعل. استخدم الديدزين والجينيستين كركائز لتنفيذ التفاعل وفقا للطرق الموضحة في القسم 3.1 بنظام تفاعل 90 ملليلترا. قم بتنقية المنتج الوسيط باستخدام HPLC تحضيري مع عمود كروماتوغرافيا سائل تحضيري.
جفف المنتجات الوسيطة المنقاة باستخدام مكثف طرد مركزي فراغ للاستخدام في المستقبل. توصيف المنتج الوسيط للتفاعل باستخدام LC-MS. قم بإذابة جزء من المنتجات الوسيطة المنقاة من تفاعلات الدايدزين والجينيستين في الميثانول لتحضير محاليل كل مركب بمعدل 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.
جهاز طرد مركزي عند 13 ، 500 مرة جم لمدة 10 دقائق وجمع المواد المستعصبة لتحليل LC-MS / MS. استخدم نفس برنامج شطف التدرج كما هو الحال في تحليل HPLC لتحليل LC-MS بحجم حقن يبلغ خمسة ميكرولتر. توصيف المنتج الوسيط للتفاعل مع الرنين المغناطيسي النووي.
قم بإذابة جزء من المنتجات الوسيطة المنقاة من تفاعل دايدزين في ستة ثنائي ميثيل سلفوكسيد منزوعة للبروتون والكربون 13 التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. سجل أطياف الرنين المغناطيسي النووي على أداة الرنين المغناطيسي النووي عند 400 ميغاهرتز للبروتون. سجل أطياف الرنين المغناطيسي النووي على جهاز الرنين المغناطيسي النووي عند 175 ميغاهرتز للكربون 13.
النتائج التمثيلية. بشكل عام ، قمنا بتصميم نهج تجريبي مشترك يتضمن إنتاج البروتين وتنقيته ، وتجارب التبلور ، ومقايسات النشاط ، وتحديد هياكل منتج التفاعل في الشكل الأول. على وجه التحديد ، حصلنا على بروتينات عالية النقاء من خلال كروماتوغرافيا التنقية المكونة من ثلاث خطوات ، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي في الشكل الثاني.
في تجارب التبلور ، حددنا الهياكل البلورية ل DgpA ، ومركب DgpB / C بدقة 2.7 أنجستروم و 2.1 أنجستروم ، على التوالي ، في الشكل 3A إلى D.اكتشفنا كذلك أن DgpA يعتمد في التأكيد المثبط التلقائي في شكله السداسي في الشكل 3B و C ، والذي تم التحقق من صحته باستخدام مقايسة تخفيض DCPIP في الشكل 3F. بعد ذلك ، وجدنا أن الجلوكوز يشكل شبكة رابطة هيدروجينية مع الأحماض الأمينية الرئيسية في جيب التعرف على الركيزة ل DgpA في الشكل 3E. بناء على ذلك ، قمنا بتصميم الطفرات وتقييم نشاط انقسام الركيزة باستخدام المعلمات الحركية في الشكل 3J.
ومن المثير للاهتمام ، أنه أثناء انقسام مركبات الفلافونويد O-glycosidic و DgpA / B / C ، لاحظنا تكوين مركبات وسيطة في الشكل 4 أ و ب ، وقد تم تحديد هذه المواد الوسيطة على أنها مركبات الفلافونويد الجليكوسيدية C من خلال تحليل الرنين المغناطيسي النووي و LC-MS في الشكل 4C إلى H ، مما يشير إلى أن DgpA / B / C يمكنه تحويل O-glycosides إلى C-glycosides. لقد كنا روادا في تكامل الكيمياء والتكنولوجيا الحيوية لدراسة الهيكل والخصائص الوظيفية لإنزيمات التمثيل الغذائي للجليكوسيدات C ، مما يدل على أن هذا حل معقول وعملي. يملأ هذا النهج الفجوات في منهجيات البحث في هذا المجال ويمكن تطبيقه بسهولة على الجينات الأخرى ذات الوظائف الأيضية المختلفة.
لذلك ، فإنه يوفر أيضا نموذجا مرجعيا جديدا للدراسات المستقبلية حول الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات الوظيفية الميكروبية الأخرى في الأمعاء.
