هذا البروتوكول مهم لإنتاج عضويات ظهارية للذاكرة يتم إنشاؤها دون تمرير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل المواد العضوية من الثدي البشري والفأر وأنسجة الذاكرة بعد الهضم الأنزيمي. نقوم بإجراء سلسلة من خطوات الطرد المركزي التفاضلية التي تعزل الكائنات العضوية الظهارية دون الحاجة إلى مرور الخلايا.
قد يواجه الفرد الذي يقوم بهذه التقنية تحديات عند تضمين الأنسجة في الكولاجين أو المصفوفة وطلائها داخل لوحة 96 بئرا. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الكولاجين المبلمر بشكل صحيح وطلاء القباب المستقرة هو مفتاح رؤية الغزو. للبدء ، اجمع الأنسجة الثديية للفأر الرحيم عن طريق تحريك أطراف الفأر واستخدام أربع إبر قياس 19 ، قم بتثبيت الماوس من الكفوف على لوح مغطى بوسادة ماصة بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.
رش بالإيثانول بنسبة 70٪ لتنعيم الفراء وتعقيم البشرة ومسح البراز بقطعة شاش أو منديل. بدءا من المنطقة التناسلية ، قم بقص خط الوسط لأعلى باستخدام مقص جراحي مع الحرص على عدم اختراق الصفاق. عند الوصول إلى الذقن ، قم بعمل قطع جانبية لكل من الترقوة وأسفل الأرجل الخلفية وقم بتثبيت جلد الفأر مشدودا على اللوحة لفضح منصات الدهون الثديية.
بعد تحديد موقع منصات الدهون الثديية الأربية والصدرية على الفئران البرية ، استخدم الملقط لرفع وسادة الدهون الثديية. باستخدام الطرف الحاد للمقص الحاد الحاد ، قم بإنشاء جيب أسفل وسادة الدهون الثديية بعيدا عن الجلد واقطع وسادة الدهون الثديية في قطعة واحدة كاملة. بمجرد إزالة ضمادات الدهون الثديية ، اشطفها في برنامج تلفزيوني قبل وضعها في طبق زراعة الأنسجة المعقم ثم انقلها بسرعة إلى غطاء زراعة الأنسجة.
فرم أورام الثدي بمشرط رقم 10 أو رقم 11 لتخفيف الأنسجة حتى تصل إلى قوام يشبه العجينة. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 10 إلى 30 ملليلتر من محلول كولاجيناز باستخدام مشرط. لضمان جمع جميع الأنسجة ، ماصة ملليلتر واحد من محلول كولاجيناز على لوحة زراعة الأنسجة والعودة إلى الأنبوب المخروطي.
ضع الأنبوب المخروطي في حاضنة اهتزاز منضدية حتى يصبح النسيج خيطيا ويصبح محلول كولاجيناز غائما. قم بتدوير 50 ملليلترا من المحلول لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 1،500 دورة في الدقيقة. نضح طاف ، وإضافة 12 ملليلتر من الوسط القاعدي وتخلط عن طريق ماصة صعودا وهبوطا ثلاث إلى أربع مرات أو تدوير المعصم برفق أثناء إمساك الأنبوب 15 مرة.
مرة أخرى ، قم بتدوير طاف النضح ، وأضف الوسط القاعدي ، واخلطه عن طريق السحب أو دوران الأنبوب كما هو موضح سابقا. بمجرد أن تستقر أثقل شظايا الأنسجة في القاع ، قم بجمع المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. بعد كل طرد مركزي, تأكد من أن الحبيبات تصبح معتمة بشكل متزايد.
تعليق مناسب للقسمة من المواد العضوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضوية بالنسبة لكمية BECM لكل بئر. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 300 غرام في درجة حرارة الغرفة وتجاهل الطافي من الأنابيب. انقل الأنابيب ذات الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من BECM إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق.
ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المواد العضوية في BECM ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات. ببطء وبعناية ماصة المواد العضوية المعلقة BECM على سطح الطلاء وملء جميع الآبار الفارغة مع PBS للحفاظ على الرطوبة. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح ل BECM بالتصلب ثم تغطيتها بالحجم المناسب من الوسائط.
لتحضير محلول الكولاجين ، امزج 375 ميكرولترا بتركيز 10 أضعاف DMEM ، و 100 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، وثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين I لذيل الفئران في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. مزيج الماصة ، مع الحرص على عدم صنع فقاعات ، ومعايرة المحلول إلى درجة حموضة من 7.2 إلى 7.4 مع كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم أو 10 أضعاف تركيز DMEM حسب الحاجة. قم بتغطية قاع الآبار بأقل كمية من الكولاجين المطلوبة لتغطية قاع البئر بالكامل عن طريق وضع كمية صغيرة من الكولاجين وهز الطبق من جانب إلى آخر إلى معطف.
اترك طبقات الكولاجين السفلية ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين. قسمة التعليق المناسب للعضويات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وفقا لكثافة العضو بالنسبة لكمية الكولاجين لكل بئر. قم بتخزين محلول الكولاجين عند أربع درجات مئوية ومراقبة البلمرة عن طريق التحقق من تكوين الألياف تحت المجهر كل 10 دقائق.
أجهزة الطرد المركزي أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في 300 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف من الأنابيب. انقل الكريات العضوية إلى الثلج وأضف الحجم المناسب من الكولاجين إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة تعليق المواد العضوية في الكولاجين ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
ببطء وبعناية ماصة الكولاجين تعلق المواد العضوية على سطح الطلاء. تم الحصول على الصور المناعية الفلورية للعضويات المدمجة في المصفوفة خارج الخلية القاعدية أو الكولاجين لدراسة أوجه التشابه في تكوين الأنسجة بين الأنواع. يمكن استخدام المواد العضوية المضمنة في مصفوفة الكولاجين لفحص الغزو وتحليلها من خلال تتبع توسع المحلاق المتفرع من العضو نفسه إما من خلال وضع علامات الطماطم الغشائية أو تلطيخ الأكتين بالقضيب.
أخيرا ، يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين للعضويات المضمنة في البارافين أن المواد العضوية تحافظ على نفس الأنسجة لسرطان الثدي. من الضروري الحفاظ على برودة BECM والكولاجين أثناء سحب القباب الهلامية لتجنب البلمرة المبكرة. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي التثبيت المطول للقباب في PFA إلى محلول متبلور في حالة إجراء تلطيخ مناعي.
يمكن أيضا استخدام المواد العضوية في الإجراءات المختبرية وفي الجسم الحي مثل شاشات الأدوية ونماذج الفئران من ورم خبيث. يمكن أن توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة للحساسية العلاجية لأنسجة الورم والخصائص النقيلية والتفاعلات المناعية.
