يوفر هذا البروتوكول طريقة واضحة لإنتاج شرائح الحصين المستعرضة عالية الجودة من الحيوانات التي تديرها r-mTBI باستخدام نموذج ACHI. ينتج عن نموذج ACHI إصابات خفيفة. لا ينطوي على كسور في الجمجمة أو نزيف أو حج القحف أو استخدام مخدر.
بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بتسجيلات كهربية مستقرة. تسمح هذه التقنيات بالتحقيق في التغيرات في اللدونة المشبكية بعد MTBI المتكرر ، والتي تكون المسببات غير معروفة إلى حد كبير ، مع إمكانية إبلاغ السبل العلاجية. سيوضح الإجراء أليسون جروس ، طالبة ماجستير في مختبري ، والدكتور إريك إيولفسون ، زميل ما بعد الدكتوراه.
ابدأ بوضع الجرذ في مخروط تقييد ، مع التأكد من أن الخطم والخياشيم قريبة من الفتحة الصغيرة المخاريط للسماح بالتهوية الكافية. منع حركة الفئران عن طريق إبقاء المخروط مغلقا في النهاية الذيلية بمشبك شعر بلاستيكي. ضع الخوذة يدويا فوق خط الوسط للفأر المقيد مع قرص الاستهداف فوق الفص الجداري الأيسر.
بعد ذلك ، ضع الجرذ على وسادة الرغوة قبل ضبط جهاز الصدمة يدويا على وضع التمديد. اخفض طرف جهاز الصدمة يدويا للاتصال بالقرص المستهدف الموجود على الخوذة. ثم اضبط جهاز الصدمة على وضع التراجع لجعل الصدمة تسحب 10 ملم فوق الخوذة.
باستخدام القرص الموجود على الذراع المجسمة ، قم بخفض طرف التأثير بمقدار 10 ملم للمس قرص الاستهداف على الخوذة مرة أخرى. بعد ذلك ، اقلب مفتاح التأثير بحيث يتم تسريع رأس الحيوان بسرعة ستة أمتار في الثانية لمدة 10 ملم. بمجرد تنشيط الجهاز ، قم بإزالة الحيوان من مخروط التقييد على الفور لإجراء بروتوكول تقييم عصبي فوري ، أو NAP.
بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بتشريح الدماغ ووضعه على ورقة ترشيح مبللة على طبق بتري مقلوب. باستخدام مشرط حاد ، قم بإزالة المخيخ وقشرة الفص الجبهي لطخة الدماغ. افصل بين نصفي الكرة الأرضية عن طريق قطع خط الوسط في الدماغ.
لإنشاء شرائح الحصين المستعرضة ، ضع نصف كرة واحد على السطح الإنسي ، وقم بإمالة المشرط عند حوالي 30 درجة إلى الداخل ، وقم بإزالة شريحة رقيقة من السطح الظهري للدماغ لتوفير سطح مستو للتركيب على المكبس. اقلب الدماغ على السطح الظهري وامسح أنسجة المخ برفق على ورق الترشيح الجاف لإزالة ACSF الزائد. ثم ، قم بتوصيل السطح الظهري للدماغ بالمكبس باستخدام غراء cyanoacrylate ، تاركا السطح البطني في وضع مستقيم.
قم بتمديد الأنبوب الخارجي للمكبس فوق الدماغ وصب الأغاروز السائل في الأنبوب حتى يتم تغطية الدماغ بالكامل. تصلب بسرعة agarose عن طريق تثبيت كتلة تقشعر لها الأبدان على أنبوب المكبس. ضع المكبس في حجرة القطاعة وقم بتأمين الحجرة بمسمار.
بعد تثبيت الشفرة ، أضف ACSF المؤكسج بالثلج البارد إلى حجرة القطاعة. في القطاعة ، اضبط سرعة القطع على أربعة ، والتذبذب على ستة ، وقم بتبديل مفتاح التقطيع الفردي المستمر إلى مستمر. ثم اضغط على Start لبدء تقسيم الدماغ عند 400 ميكرومتر.
عندما تقسم القطاعة الدماغ ، استخدم ماصة باستور ذات القطر الكبير لنقل كل شريحة إلى حمام الاسترداد من ACSF المؤكسج. دع الشرائح تتعافى عند 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم اتركها لتتعافى لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوات لإنشاء شرائح من نصف الكرة الثاني.
باستخدام مجتذب ماصة صغيرة متاح تجاريا ، اسحب أقطاب تسجيل من واحد إلى اثنين ميغا أوم من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات 10 سم بقطر خارجي 1.5 ملم وقطر داخلي 1.1 ملم. استخدم ماصة باستور وانقل شريحة الحصين من حمام التعافي إلى الحجرة التي يتم رشها ب ACSF المكرب والحفاظ عليها عند 30 درجة مئوية. قم بتوجيه شريحة الدماغ بحيث يكون التلفيف المسنن وطبقة الخلايا الحبيبية مرئية في مجال الرؤية.
استخدم مجهرا مستقيما لتصور التلفيف المسنن باستخدام بصريات مائلة. ضع قطبا محفزا ثنائي القطب متحد المركز لتنشيط المسار المثقوب الإنسي ، أو ألياف MPP ، في الثلث الأوسط من الطبقة الجزيئية. بعد ذلك ، ضع ماصة زجاجية مملوءة ب ACSF في MPP.
ابدأ بالأقطاب الكهربائية بعيدا عن بعضها البعض ، لأن لمس الأنسجة سيؤدي إلى إتلاف الألياف. بمجرد وضع أقطاب التحفيز والتسجيل ، تصور استجابات المجال المثارة باستخدام مكبر للصوت ومحول رقمي وبرنامج تسجيل. ابحث عن جهد ما بعد المشبكي الميداني المثير المناسب ، أو EPSP الميداني ، عن طريق تحفيز الأنسجة بنبضات التيار وضمان سعة لا تقل عن 0.7 مللي فولت مع كرة ألياف صافية أصغر من EPSP الحقل.
قم بزيادة وضبط كثافة المحاكاة حتى يصل EPSP الميداني إلى 70٪ من السعة القصوى. بعد ذلك ، قم بإنشاء خط أساس مستقر للتكييف المسبق لمدة 20 دقيقة مع نبضات 0.12 مللي ثانية يتم تسليمها عند 0.067 هرتز. بالنسبة للشريحة المستقرة ، يجب أن يكون الميل الأولي ل fEPSP أقل من 10٪ من التباين ويجب أن يكون ميل الخط الأكثر ملاءمة من خلال منحدرات EPSP للحقل المرسوم أقل من 0.5.
تحديد التغيرات في الخواص المشبكية الأساسية باستخدام منبهات النبض المزدوج وبناء منحنيات المدخلات / المخرجات للتحفيز / الاستجابة. لاختبار النبض المزدوج ، قم بتطبيق سلسلة من النبضات المقترنة بفاصل نبضي يبلغ 50 مللي ثانية عند 0.033 هرتز. بالنسبة لمنحنيات الإدخال / الإخراج ، قم بتطبيق سلسلة من شدة التحفيز المتزايدة من 0.0 إلى 0.24 مللي ثانية عند 0.033 هرتز لرسم تغيير حجم استجابة EPSP للمجال.
لدراسة الاكتئاب على المدى الطويل الذي يعتمد في المقام الأول على تنشيط مستقبلات CB1 ، استخدم 6،000 نبضة عند 10 هرتز. بالنسبة لتسجيلات ما بعد التكييف ، استأنف لمدة 60 دقيقة إضافية باستخدام محفزات أحادية النبضة تبلغ 0.12 مللي ثانية بتردد 0.067 هرتز. بعد تسجيل ما بعد التكييف ، قم بإدارة محفزات النبض المزدوج متبوعة بمنحنى الإدخال / الإخراج.
قارنها بالتسجيلات الأساسية بالتغيرات الملحوظة في خصائص الإطلاق قبل المشبكي وقم بتقييم صحة الشريحة للتسجيلات طويلة المدى. أثناء التحليل ، التزم بمعايير الاستبعاد لتحديد الاحتفاظ بالبيانات من الشرائح الفردية في مجموعة بيانات اللدونة قبل المشبكية. استبعد الشرائح التي تعرض منحدرا كبيرا في خط يناسب أفضل منحدرات EPSP للمجال أثناء خط أساس التكييف المسبق، وعدم الاستقرار في خط أساس التكييف المسبق، وعدم الاستقرار في فترة ما بعد الشرط.
عند خط الأساس ، أظهر بروتوكول التقييم العصبي ، أو درجات NAP ، عدم وجود فرق بين الفئران الوهمية والمتكررة mTBI. بعد جميع جلسات إصابة الرأس المغلقة المستيقظة ، أظهرت الفئران mTBI المتكررة إعاقات كبيرة في مهام NAP مقارنة بالشام ، مما يشير إلى حدوث عجز سلوكي دقيق ولكنه كبير. تم إعطاء سلسلة من النبضات المزدوجة وتم حساب نسبة حجم EPSP للحقل الثاني بالنسبة إلى EPSP للحقل الأول.
لم تختلف نسب النبض المزدوج بين الفئران الوهمية والمتكررة mTBI ، مما يكشف أن الفئران mTBI المتكررة لم تغير فسيولوجيا متشابك الأساسية في مدخلات MPP إلى التلفيف المسنن. عندما تم إعطاء بروتوكول 10 هرتز للحث على اكتئاب طويل الأجل ، كان هناك انخفاض مؤقت ولكنه كبير في قدرة مدخلات MPP على التلفيف المسنن للحفاظ على الاكتئاب طويل المدى في اليوم الأول بعد الإصابة. ومع ذلك ، بحلول اليوم السابع بعد الإصابة ، أظهرت شرائح من الحيوانات الوهمية والمتكررة mTBI اكتئابا مكافئا طويل الأجل ، على الرغم من وجود مؤشر على وجود اتجاه طفيف لحيوانات mTBI المتكررة لإظهار زيادة في الاكتئاب طويل الأجل.
يعد التخطيط لعملية التشريح والقطع مسبقا أمرا بالغ الأهمية لإنشاء شرائح قرنية قابلة للحياة بنجاح والحصول على تسجيلات فسيولوجية كهربية مستقرة. يخلق هذا الإجراء منصة تجريبية مستقرة يمكن استخدامها لفحص الفيزيولوجيا المرضية TBI وتطوير طرق علاجية جديدة. إن الحركة من إزالة الدماغ إلى وضعه لقطع الفيلم المضغوط لشرائح الحصين المستعرضة مهمة ، وكذلك الوضع الدقيق للأقطاب الكهربائية في التلفيف المسنن.
