Ce protocole fournit une méthode claire pour produire des tranches transversales d’hippocampe de haute qualité à partir d’animaux administrés par r-mTBI avec le modèle ACHI. Le modèle ACHI produit des blessures légères. Il n’implique pas de fractures ou de saignements du crâne, de craniotomies ou d’utilisation d’anesthésiques.
De plus, il permet des enregistrements électrophysiologiques stables. Ces techniques permettent d’étudier les changements dans la plasticité synaptique à la suite d’un TCCL répété, dont l’étiologie est largement inconnue, avec le potentiel d’éclairer les voies thérapeutiques. La procédure sera présentée par Allyson Gross, étudiante à la maîtrise pour mon laboratoire, et le Dr Eric Eyolfson, boursier postdoctoral.
Commencez par placer le rat dans un cône de contention, en veillant à ce que le museau et les narines soient proches de la petite ouverture des cônes pour permettre une ventilation adéquate. Empêchez le mouvement du rat en maintenant le cône fermé à l’extrémité caudale avec une pince à cheveux en plastique. Positionnez manuellement le casque sur la ligne médiane du rat retenu avec le disque de ciblage sur le lobe pariétal gauche.
Ensuite, placez le rat sur le coussin de mousse avant de régler manuellement l’impacteur sur la position d’extension. Abaissez manuellement la pointe de l’impacteur pour entrer en contact avec le disque cible du casque. Réglez ensuite l’élément de frappe en position de rétraction pour que l’élément de frappe se retire à 10 millimètres au-dessus du casque.
À l’aide du cadran du bras stéréotaxique, abaissez la pointe d’impact de 10 millimètres pour toucher à nouveau le disque de ciblage du casque. Ensuite, actionnez l’interrupteur d’impact pour que la tête de l’animal soit rapidement accélérée à six mètres par seconde pendant 10 millimètres. Une fois le dispositif activé, retirez immédiatement l’animal du cône de contention pour effectuer un protocole d’évaluation neurologique immédiat, ou PNA.
Après avoir euthanasié la souris, disséquez le cerveau et placez-le sur un papier filtre mouillé sur une boîte de Petri à l’envers. À l’aide d’un scalpel pointu, retirez le cervelet et le cortex préfrontal pour éponger le cerveau. Séparez les deux hémisphères en coupant la ligne médiane du cerveau.
Pour créer des tranches transversales de l’hippocampe, placez un hémisphère sur la surface médiale, inclinez le scalpel à environ 30 degrés vers l’intérieur et retirez une fine tranche de la surface dorsale du cerveau pour fournir une surface plane à monter sur le piston. Retournez le cerveau sur la surface dorsale et tamponnez doucement le tissu cérébral sur du papier filtre sec pour éliminer l’excès d’ACSF. Ensuite, fixez la surface dorsale du cerveau au piston à l’aide de colle cyanoacrylate, en laissant la surface ventrale verticale.
Étendez le tube externe du piston sur le cerveau et versez le liquide agarose dans le tube jusqu’à ce que le cerveau soit complètement recouvert. Solidifiez rapidement l’agarose en serrant un bloc de refroidissement sur le tube de piston. Placez le piston dans la chambre de la trancheuse et fixez la chambre avec une vis.
Après avoir fixé la lame, ajoutez de l’ACSF oxygéné glacé dans la chambre de trancheuse. Sur la trancheuse, réglez la vitesse de coupe sur quatre, l’oscillation sur six et basculez le commutateur de découpage simple continu sur Continu. Ensuite, appuyez sur Démarrer pour commencer à sectionner le cerveau à 400 micromètres.
Lorsque la trancheuse coupe le cerveau, utilisez une pipette Pasteur de grand diamètre pour transférer chaque tranche dans le bain de récupération de l’ACSF oxygéné. Laissez les tranches récupérer à 32 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis laissez-les récupérer pendant 30 minutes supplémentaires à température ambiante. Répétez ces étapes pour créer des tranches à partir du deuxième hémisphère.
À l’aide d’un extracteur de micropipettes disponible dans le commerce, tirez des électrodes d’enregistrement d’un à deux mégaohms à partir de capillaires en verre borosilicaté de 10 centimètres d’un diamètre extérieur de 1,5 millimètre et d’un diamètre intérieur de 1,1 millimètre. Utilisez une pipette Pasteur et transférez une tranche hippocampique du bain de récupération à la chambre perfusée avec de l’ACSF carbogéné et maintenue à 30 degrés Celsius. Orientez la tranche du cerveau de manière à ce que le gyrus denté et la couche de cellules granulaires soient visibles dans le champ de vision.
Utilisez un microscope droit pour visualiser le gyrus denté avec une optique oblique. Placez une électrode concentrique stimulant bipolaire pour activer le chemin perforent médial, ou fibres MPP, dans le tiers moyen de la couche moléculaire. Ensuite, placez une micropipette en verre remplie d’ACSF dans le MPP.
Commencez avec les électrodes plus éloignées, car toucher le tissu endommagera les fibres. Une fois les électrodes de stimulation et d’enregistrement positionnées, visualisez les réponses de champ évoquées à l’aide d’un amplificateur, d’un numériseur et d’un logiciel d’enregistrement. Trouver un potentiel postsynaptique excitateur de champ approprié, ou EPSP de champ, en stimulant le tissu avec des impulsions de courant et en assurant une amplitude minimale de 0,7 millivolts avec une volée de fibre claire plus petite que l’EPSP de champ.
Augmenter et régler l’intensité de simulation jusqu’à ce que l’EPSP du champ soit à 70% de l’amplitude maximale. Ensuite, établissez une ligne de base de préconditionnement stable pendant 20 minutes avec des impulsions de 0,12 milliseconde délivrées à 0,067 hertz. Pour une tranche stable, la pente initiale du fEPSP devrait être inférieure à 10 % de variabilité et la pente de la ligne de meilleur ajustement à travers les pentes EPSP du champ tracé devrait être inférieure à 0,5.
Déterminer les changements dans les propriétés synaptiques de base en utilisant des stimuli à impulsions appariées et en construisant des courbes d’entrée/sortie stimulus/réponse. Pour le test d’impulsion appariée, appliquer une série d’impulsions appariées avec un intervalle d’impulsions inter-impulsions de 50 millisecondes à 0,033 hertz. Pour les courbes entrées/sorties, appliquer une série d’intensités de stimulus croissantes de 0,0 à 0,24 milliseconde à 0,033 hertz pour tracer le changement de taille de réponse EPSP sur le terrain.
Pour étudier la dépression à long terme dépendant principalement de l’activation du récepteur CB1, utilisez 6 000 impulsions à 10 hertz. Pour les enregistrements post-conditionnement, reprendre pendant 60 minutes supplémentaires en utilisant des stimulations à impulsion unique de 0,12 milliseconde à une fréquence de 0,067 hertz. Après l’enregistrement post-conditionnement, administrer les stimuli d’impulsion appariés suivis d’une courbe entrée/sortie.
Comparez-les aux enregistrements de référence aux altérations observées des propriétés de libération présynaptique et évaluez la santé de la tranche pour les enregistrements à long terme. Au cours de l’analyse, respectez les critères d’exclusion pour déterminer la rétention des données des tranches individuelles dans l’ensemble de données sur la plasticité présynaptique. Exclure les tranches présentant une pente importante dans une ligne de mieux ajustée des pentes EPSP sur le terrain pendant la ligne de base de préconditionnement, l’instabilité dans la ligne de base de préconditionnement et l’instabilité dans la période post-condition.
Au départ, le protocole d’évaluation neurologique, ou scores NAP, n’a montré aucune différence entre les rats tâlins crâniens simulés et répétés. Après toutes les séances éveillées de traumatisme crânien fermé, les rats mTBI répétés ont montré des déficiences significatives dans les tâches NAP par rapport aux simulacres, indiquant que des déficits comportementaux subtils mais significatifs ont été produits. Une série d’impulsions appariées a été administrée et le rapport de la taille du deuxième EPSP de champ a été calculé par rapport au premier EPSP de champ.
Les rapports d’impulsion appariés ne différaient pas entre les rats mTBI simulés et répétés, révélant que les rats mTBI répétés ne modifiaient pas la physiologie synaptique de base dans l’entrée MPP dans le gyrus denté. Lorsqu’un protocole de 10 hertz a été administré pour induire une dépression à long terme, il y a eu une diminution temporaire mais significative de la capacité de l’entrée MPP dans le gyrus denté à maintenir la dépression à long terme le premier jour après la blessure. Cependant, au septième jour après la blessure, les tranches d’animaux ayant subi un TCL simulé et répété présentaient une dépression à long terme équivalente, bien qu’il y ait eu une légère tendance chez les animaux ayant subi un TCL répété à présenter une augmentation de la dépression à long terme.
La planification du processus de dissection et de coupe à l’avance est essentielle pour créer avec succès des tranches d’hippocampe viables et obtenir des enregistrements électrophysiologiques stables. Cette procédure crée une plate-forme expérimentale stable qui peut être utilisée pour examiner la physiopathologie des TCC et développer de nouvelles voies thérapeutiques. Le passage de l’ablation du cerveau au positionnement pour le couper dans le film comprimé pour les tranches transversales de l’hippocampe est important, tout comme le placement précis des électrodes dans le gyrus denté.
