تسمح هذه الطريقة بدراسة تكوينات مجمعات البروتين التي تتطلب تعبيرا مشتركا لعينات اختبار فعالة ، مثل تكوين heterodimers. تتمثل الإمكانات النهائية الرئيسية لهذه الطريقة في استغلال التعبير المشترك للبروتينات المدروسة ذات العلامات التفاضلية باستخدام مجموعات من النواقل المتوافقة لتعزيز التجميع المعقد الفعال ، إلى جانب سير العمل الفعال من حيث الوقت وقابلية التوسع مما يسمح باختبار التصحيح السريع للتفاعلات المتعددة. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للفحص السريع للتعبير الأمثل للبروتين وظروف التنقية.
يساعد العرض المرئي على تنفيذ الخطوات المهمة للبروتوكول بشكل صحيح مثل إعداد التعبير المشترك وتعطيل الخلية وخطوات القائمة المنسدلة اللاحقة. للبدء ، تنمو سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) في وسائط Luria-Bertani ، أو LB ، عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية ، أو OD ، من 0.1 إلى 0.2. أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من التعليق البكتيري لمدة دقيقة واحدة عند 9،000 غرام عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية.
ثم أضف 0.5 ملليلتر من محلول تحويل الجليد البارد ، أو TB ، واحتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 8،000 G عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول السل ، و 100 نانوجرام من كل ناقل ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
يسخن على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 150 ثانية ، ثم يبرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط LB بدون مضادات حيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسائط LB قبل طلاء التعليق على لوحة أجار LB تحتوي على 0.5٪ جلوكوز ومضادات حيوية مقابلة.
احتضان اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا من اللوحة بملليلتر من وسائط LB إلى 50 ملليلتر من وسائط LB مع المضادات الحيوية المقابلة. أضف أيونات المعادن أو غيرها من العوامل المساعدة المعروفة قبل تخزين القسمة مع 20٪ من الجلسرين عند 70 درجة مئوية تحت الصفر للتجارب اللاحقة.
تنمو الخلايا مع دوران ثابت من 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى OD من 0.5 إلى 0.7. قم بتبريد الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة IPTG إلى تركيز نهائي يبلغ ملليمول واحد. قم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية كعنصر تحكم في العينة غير المستحثة.
احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قسم التعليق البكتيري إلى قسمين وقم بتخزين حصص 20 ميكرولتر لتأكيد تعبير البروتين. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المتبقية في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة.
لمقايسة السحب ، أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من محلول التحلل المثلج البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل التقليل المضافة مباشرة قبل التجربة. اضبط تركيبة المخزن المؤقت للبروتينات المختبرة. تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد وتخزين حصص 20 ميكرولتر للكهربائي.
أجهزة الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة 30 دقيقة وجمع 20 ميكرولتر من المحللة الموضحة للرحلان الكهربائي. قم بموازنة الراتنج مع ملليلتر واحد من محلول تحلل الثلج البارد لمدة 10 دقائق ، ثم جهاز طرد مركزي عند 2،000 جم لمدة 30 ثانية وتخلص من المادة الطافية. أضف محللات الخلية إلى الراتنج واحتضانها لمدة 10 دقائق بدوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة.
ثم ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة الطافية قبل جمع 20 ميكرولتر من الجزء غير المنضم للتحليل. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل المثلج واحتضانه لمدة دقيقة واحدة. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف.
بعد ذلك ، قم بإجراء غسلتين طويلتين باستخدام عازل غسيل بارد مثلج. بعد الغسيل الثاني ، قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف في شاكر عند 1،200 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تحليل البروتينات المستخلصة مع SDS بولي أكريلاميد هلام الكهربائي.
تظهر هنا دراسات حول المجال المرتبط بإصبع الزنك ، أو ZAD ، وثنائي الهومو في البروتين المرتبط بالمالتوز ، أو MBP ، ومقايسات السحب 6xHistidin. يظهر التعبير المشترك ل MBP و Thioredoxin 6xHistidine-used ZADs نشاطا جيدا وقابلا للتكرار ، حيث يظهر كنطاق إضافي في نتائج SDS-PAGE لمقايسة MBP المنسدلة. يوضح هنا مثال آخر على استخدام الطريقة لدراسة التكوين المركب البديل.
في مقايسة التعبير المشترك ، تفاعل ENY2 الموسوم ب 6xHistidine مع كل من Sgf11 و MBP-CTCF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، ولكن لم يكن GST-Sgf11 موجودا في عمليات سحب MBP والعكس صحيح. يتم عرض مقارنة خطوة بخطوة للفترات الزمنية المطلوبة في سير عمل مقايسة القائمة المنسدلة التقليدية مقارنة بالقائمة المنسدلة المقترنة بالتعبير المشترك هنا. نتائج استخدام كلتا التقنيتين لدراسة نفس التفاعل بين مجال BTB لبروتين CP190 والمجال C الموسوم بضريبة السلع والخدمات لبروتين ذبابة الفاكهة CTCF موضحة هنا.
يعد الاختيار الصحيح لاختبار التقارب والذوبان ، Thioredoxin أو GST أو MBP ، أمرا بالغ الأهمية للتنفيذ الفعال للفحص. خطوة حاسمة أخرى هي تعطيل الخلايا بسرعة وموحدة. يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتنة متعددة الأطراف.
تسمح هذه الطريقة بالدراسة المباشرة لتشكيل heterodimer بين مجالات البروتين التي تشكل بخلاف ذلك متجانسات لا تنفصل أثناء حضانة البروتينات المنقاة في الفحص المنسدل التقليدي.
