تسمح هذه الطريقة بعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بنقاوة أعلى من تلك التي تحققها الطرد المركزي الكلاسيكي التفاضلي. هذه التقنية بسيطة ومريحة وسهلة التشغيل ، والتي يمكن أن توفر الدعم المنهجي لدراسة الحويصلات الصغيرة خارج الخلية. للبدء ، قم بإزالة عينة الأنسجة من الفريزر 80 درجة مئوية.
ضع ما يقرب من 400 ملليغرام من الأنسجة في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج ، وفرم الأنسجة جيدا بمشرط. نقل الأنسجة إلى لوحة ستة آبار مع 1.5 ملليلتر من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، أو sEVs.
بعد الحضانة ، ضع صفيحة الآبار الستة على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولترا من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل لإيقاف عملية الهضم. بعد ذلك ، انقل محلول الهضم إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر ، وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي حطام كبير للأنسجة.
أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 500 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة حطام الأنسجة الصغيرة ، وجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي جديد 2 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي طاف في 3،000 غرام لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يوشك طرف الماصة على لمس الحطام الأبيض في الأسفل.
بعد تكرار الطرد المركزي للسائل المتبقي ، قم بتجميع المادة الطافية في الأنبوب دون إزعاج الحطام. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها في 12،000 غرام لمدة 20 دقيقة ، ونقل 900 ميكرولتر من الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي 4.7 ملم. كرر الطرد المركزي للسائل المتبقي ، ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق.
املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي طاف في 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS.
بعد تكرار الطرد المركزي عند 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة ، أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS. نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد ، وقم بترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر. قم بتخزين المرشح عند 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs. تحقق من حجم محلول التنظيف. ثم لاحظ الفرق بين مستويات الغمد وسائل النفايات.
بعد 20 ثانية من تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ، قم بتشغيل الكمبيوتر. انتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج. انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.
بعد ذلك ، انقر فوق غمد فلو ، وحدد بدء التشغيل.ضع المياه فائقة النقاء على منصة التحميل. بعد أربع دقائق ، انقر فوق عينة وتعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل.
انقر فوق عينة، وحدد تعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. ثم ضع الأنبوب الذي يحتوي على الماء عالي النقاء على منصة التحميل. في نفس الوقت ، انقر فوق عينة وتعزيز، متبوعا بتدفق غمد وتطهير.
انقر فوق التشغيل اليدوي ، وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز لمدة دقيقة واحدة ، وفي نفس الوقت حدد 250 نانومتر مراقبة جودة الكريات النانوية السيليكا الفلورية القياسية في معلومات العينة. حدد أخذ العينات من عينة ، وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM.
ثم ، انقر فوق أخذ العينات التلقائي ، وأدخل 1.0 في مجموعة أخذ العينات لإصلاح الضغط عند كيلو باسكال واحد. انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة كبيرة. اضبط الوضع الأفقي لليزر ، واضبط الليزر على ميكرومترين.
ثم ، انقر باستمرار على L و R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة. انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. ثم احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ.
ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل. انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز ، وبعد دقيقة واحدة انقر فوق عينة وتفريغ. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.
ضع الأنبوب القياسي لحجم الجسيمات على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة لمدة دقيقة واحدة. حدد 68 إلى 155 S16M-Exo لمراقبة الجودة في معلومات العينة ، وانقر فوق عينة ، ثم أخذ العينات. بعد ذلك ، انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة صغيرة.
انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ. بعد إزالة البقايا بمحلول التنظيف ، ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ، وقم بتنفيذ الخطوات الموضحة للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات.
بعد ذلك ، قم بتنظيف الطرف الشعري كما هو موضح سابقا ، وقم بتحميل عينة sEV لتحليل البيانات الموضحة سابقا للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات. تم فحص sEVs المنقى تحت المجهر الإلكتروني النافذ ، والذي كشف عن وجود sEVs مع مورفولوجيا على شكل كوب. تم إجراء قياس التدفق الخلوي ل sEVs.
وتراوح حجم الجسيمات من 40 إلى 200 نانومتر ، وكان متوسط حجم الجسيمات 89 نانومتر. تم العثور على نقاء sEVs المخصب ليكون 68.32٪ تم الكشف عن علامات البروتين من sEVs مثل CD63 و CD9 و TSG101 بواسطة اللطخة الغربية. تم استخدام GM130 كعلامة تحكم سلبية ل sEVs ، والتي تم العثور عليها في خلايا الأنسجة ولكن ليس في sEVs.
من الأهمية بمكان تنفيذ خطوات الهضم الأنزيمي ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح الغشائي بعناية فائقة لضمان نقاء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية.
