يستخدم هذا البروتوكول المجهر فائق الدقة ، وتحديدا المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي ، المعروف أيضا باسم dSTORM ، لتجاوز حد الحيود وتصور المركبات الكهربائية بدقة نانومتر في ثلاثة أبعاد. ميزة واحدة ملحوظة من dSTORM هو قدرته على تصور مباشرة الجسيمات تحت مستوى الحيود من الضوء دون الخطوات الضارة التي تغير الطبيعة الكيميائية الحيوية للEV. العديد من الفيروسات المتميزة تطوريا تستخدم إشارات EV ، لذلك ، يمكن استخدام dSTORM لتوصيف المركبات الكهربائية للمؤشرات الحيوية للمرض والتقدم ، وكذلك لتصور جزيئات الفيروس الفردية ، مثل السارس -CoV2. ابدأ بوضع الحويصلات المنقية من الألفة، أو الحويصلات خارج الخلية، على قاع الزجاج، والميكروسليد، وصفائح ثماني آبار في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر، والسماح لهم بالتمسك بالسطح بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
دون إزالة الحل الحالي من لوحة ثمانية آبار، إصلاح المركبات الكهربائية على لوحات بإضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني 1X إلى الحل المحتوي على EV في كل بئر والسماح للوحات لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بارافورمالدهيد بعناية والحل الزائد مع micropipette لعدم إزعاج المركبات الكهربائية. غسل EV مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة paraformaldehyde الزائدة.
إجراء عملية الغسيل ثلاث مرات. إزالة فائض 1X برنامج تلفزيوني. إعداد 250 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت dSTORM Bcubed لكل عينة عن طريق إنشاء حل من خمسة ملليمولار الأولية ديوكسيجيناز المخفف في المخزن المؤقت للتصوير وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
أضف 250 ميكرولتر من العازلة المعدة إلى كل بئر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، واحتضان اللوحات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير لمسح الجزيئات المؤكدة. يمكن تصور المركبات الكهربائية على الفور أو تخزينها في أربع درجات مئوية لمدة أسبوع. لإعداد الخرز اللازم لمعايرة المجهر فائق الدقة ، تمييع 100 نانومتر ميكروسفير إلى تركيز 0.5٪ في مياه درجة البيولوجيا الجزيئية ، وماصة 200 ميكرولتر في كل بئر من قاع الزجاج ، والميكروسميليد ، لوحة من ثمانية آبار.
السماح للخرزات لتسوية في الآبار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. دون إزالة الحل الحالي، إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر إلى محلول حبة المعايرة، والسماح لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة البارافورمالديهايد بعناية مع micropipette لعدم إزعاج الخرز، وغسل الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
إعداد المخزن المؤقت كما هو موضح في المخطوطة. إزالة برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعدة لكل بئر. السماح للمخزن المؤقت بالجلوس لمدة 20 دقيقة قبل التصور.
استخدم زر توصيل المجهر للاتصال بالمجهر ثلاثي الأبعاد قبل وضع أي شيء على المسرح. إضافة 100X النفط إلى الهدف، ووضع مركز البئر على رأس الهدف. في الإعداد Acquire ، قم بتشغيل ليزر الإثارة 473-و 640 نانومتر وانقر على View.
دون تفعيل العدسة ثلاثية الأبعاد، اعرض الخرز تحت إعداد تشبع الفوتون بالنقر على عدد الفوتونات في خيارات عرض الصور. تعيين القوى الليزر الأولية إلى 8.4 ملليواط لليزر 473 نانومتر، و 11.6 ملليواط لليزر 640 نانومتر. تقليل تركيز الليزر إلى حوالي ناقص 300 نانومتر أو المستوى البؤري للخرز المعايرة لإنتاج دقة واضحة من الخرز الفردية.
بمجرد تركيز الطائرة Z، قم بتعديل مستويات طاقة الليزر بشكل أكبر لمراعاة التباين في كل مجال من مجالات الرؤية. تحت وظائف الأداة ، أكمل معايرة الخرائط ثلاثية الأبعاد ومعايرة رسم خرائط القنوات للحصول على الأخطاء على المحور X و Y و Z. تعيين الحد الأقصى لعدد حقول العرض إلى 20، والعدد المستهدف من النقاط إلى 4000، والمسافة القصوى بين القنوات إلى 5.0 بكسل، ونصف قطر الاستبعاد بين القنوات إلى 10.0 بكسل أثناء معايرة رسم خرائط القناة.
تأكد من أن المعايرة تنتج تغطية نقطة أكبر من 90٪ ونوعية رسم الخرائط الجيدة. حفظ بيانات المعايرة المعطاة لاكتساب الصور في المستقبل. إضافة 100X النفط على الهدف، ووضع المركبات الكهربائية المعدة على المجهر.
دون تفعيل العدسة ثلاثية الأبعاد، قم بتشغيل ليزر الإثارة 640 نانومتر، ورفعه في البداية إلى ما بين 1.2 و 12.5 مللي واط، اعتمادا على كثافة الإشارة في مجال الرؤية لإثارة الغشاء الأحمر، والتداخل، والمركبات الكهربائية الملطخة بالصبغة. ضمن خيارات عرض الصور، قم بتبديل طريقة العرض من تشبع الفوتون إلى المئينات لتصور المركبات الكهربائية بشكل أفضل. ضبط طاقة الليزر لتقليل الضوضاء مع تعظيم إشارة والحفاظ على جميع المعلمات الأخرى.
ضبط التركيز من Z-الطائرة بالنقر فوق رمز أعلى أو أسفل على المحور Z. تعيين وقت التعرض إلى 20 مللي ثانية، والتقاط الإطار إلى 10،000 إطار، وقوة الليزر الأولية إلى ما بين 1،2 و 12،5 مللي واط، اعتمادا على كثافة الإشارة ومجال الرؤية. قم بتنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد باستخدام الرمز، وابدأ عملية الاستحواذ بالنقر على زر الحصول.
خلال عملية الحصول على الصورة، ارفع طاقة الليزر بمقدار ثلاث زيادات بمقدار 10 كل 1000 إطار، أو ما يكفي للحفاظ على نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. لا تقم بضبط الطائرة Z أثناء عملية الامتلاك. بعد الحصول على الصورة، قم بالتبديل إلى نافذة تحليل العرض.
قم بإجراء تصحيح الانجراف على الصورة غير المصفاة، ثم قم بتنشيط عوامل التصفية. ضبط عدد الفوتونات ودقة التعريب و sigmas و فهرس الإطارات، كما هو مذكور في المخطوطة. تراكب X، Y، Z-الطائرة عرض أداة على طول المحور العاشر من المركبات الكهربائية الفردية من مجال العرض وتصدير ملفات csv الفردية للأحداث photoswitching.
تقسيم المركبات الكهربائية الفردية على X، Y-محور في X بواسطة ص حقل الرؤية باستخدام أداة مخطط التكرار الخط، الذي دبابيس الأحداث photoswitching في مجموعات المسافة المحددة. التقاط صور من المركبات الكهربائية واحد وحفظها كملفات tif. إنشاء مقاطع فيديو ثلاثية الأبعاد لمركبات EVs الفردية باستخدام أداة تصور ثلاثي الأبعاد ولون وفقا للموضع على طول المحور Z.
بعد معايرة المجهر الذي أنتج خطأ متوسط 16 نانومتر على X و Y-axis و 38 نانومتر على محور Z ، تم تصور المركبات الكهربائية u20s المنقى بنجاح بدقة تصل إلى 20 نانومتر على المحور X و Y و 50 نانومتر على طول المحور Z. تصور المركبات الكهربائية الفردية من خلال dSTORM في صور ثلاثية الأبعاد طوال التعرض للإطار 10،000 كما تم زيادة قوة الليزر، وكانت واضحة بسهولة في الصورة المكتسبة. بعد اقتناء صورة التصحيح في Z - الطائرة ، الفوتون التهم ، سيغماس ، ودقة توطين الصورة التي أعيد بناؤها أدى إلى دقة واضحة من EV في 3D.
وEV photowitched خلال 7، 000 فقط الأطر الأولى، كما يتضح من أسطورة في الزاوية اليمنى العليا. ويؤكد الرسم البياني أن غالبية الأحداث الضوئية وقعت في دائرة نصف قطرها 100 نانومتر، مما يؤكد أن EV المرئي هو إكسوسوم، وأن عزل المركبات الكهربائية ذات القطر الصغير كان ناجحا. أكد تحليل توزيع الحجم الذي تم إجراؤه على المركبات الكهربائية الأخرى التي يتم تتبعها بشكل فردي باستخدام أداة الرسم البياني للخط وأداة عرض X و Y و Z-plane أن معظم أحداث التعقب الضوئي وقعت ضمن دائرة نصف قطرها 100 نانومتر من المركز.
تم زيادة الخطأ على طول المحور Z، مما أدى إلى صورة نهائية ممدود من EV على طول المحور المحوري. لم تكن أحداث الحكة الضوئية مرتبطة بحجم EV ، مما يدل على أنه يمكن استخدام التوصيف القائم على dSTORM للمركبات الكهربائية الصغيرة مثل exosomes والفيروسات الصغيرة المغلفة التي يقل قطرها عن 100 نانومتر. أثناء أداء dSTORM من المهم أن نتذكر لتعيين قوة الليزر الأولية منخفضة جدا، ورفع ببطء في جميع أنحاء الحصول على الصورة من أجل منع photobleaching.
منذ تطورها ، سمحت dSTORM للباحثين بفهم أفضل لمورفولوجيا الهياكل شبه الخلوية التي كان من المستحيل تصورها في السابق بسبب حد الحيود للتنظير الضوئي النموذجي.
