يوفر هذا البروتوكول بيانات كمية حول كيفية تفاعل أنظمة الناقل مع الخلايا. البيانات الكمية هي المفتاح للهندسة والتحسين. يسمح لنا بالانتقال من الأسئلة البيولوجية بنعم أو لا ، إلى مقدار الأسئلة.
هذه التقنية مفيدة لتحويل النتائج من أداء حامل الدواء قبل السريري ، والتي كانت نوعية ، إلى نتائج كمية. وهذا يعمل حتى عندما تميز الناقل الخاص بك على نظام مختلف عن توصيف خلاياك. قد يستغرق الأمر بعض التكرارات للعثور على التخفيف الأمثل للحامل الذي يقع ضمن النطاقات الخطية أو الكمية لجانب النانو.
خذ وقتك لإيجاد الظروف المناسبة. للبدء ، قم بتركيب خلية التدفق على وحدة الليزر. اغسل خلية التدفق ببطء بمعدل 0.1 ملليلتر في الثانية مع ملليلتر واحد من الماء المقطر.
إذا تشكلت فقاعات داخل خلية التدفق ، فقم بسحب التعليق جزئيا لدمج الفقاعة مع واجهة الهواء والسائل قبل المتابعة. ثم قم بقفل وحدة الليزر بأكملها في مكانها داخل الجهاز. ابدأ تشغيل الكاميرا في منتصف عملية التنظيف تقريبا.
تأكد من التأكد من غسل حطام الناقل. حدد التقاط لفتح علامة تبويب إعدادات الالتقاط وانقر فوق بدء تشغيل الكاميرا. قم بقيادة النظام باستخدام ملليلتر واحد من الهواء.
إذا كانت أي ناقلات ثابتة مرئية على الشاشة ، فقم بتنظيف خلية التدفق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد الناقلات لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، من خلال ضمان تعليق الناقلات جيدا عن طريق الصوتنة أو الدوامة ، اعتمادا على نظام الناقل المعني. قم بتخفيف الناقلات في الماء لتحضير ما لا يقل عن 0.6 إلى ملليلتر واحد من كل عينة بتركيز ناقل يتراوح بين 1x10 إلى السابع و 1x10 إلى الناقلات التاسعة لكل ملليلتر.
أخرج وحدة الليزر وضعها في وضع مستقيم. قم بإسقاط العينة الحاملة الأولى في حقنة ملليلتر واحد وأرفق المحقنة بمدخل الأنبوب. ثم قم بتحميل العينة بعناية في خلية التدفق.
إذا تشكلت فقاعات داخل خلية التدفق ، فقم بسحب التعليق جزئيا لدمج الفقاعة مع واجهة الهواء والسائل قبل المتابعة. تأكد من ملء خلية التدفق بأكملها بالسائل ، ثم أوقف التحميل مؤقتا. اضبط تركيز الكاميرا إذا لزم الأمر لتصور شركات النقل الفردية.
قم بإجراء تعديلات التركيز الخشن باستخدام المقبض الدوار على الجانب الأيمن من الجهاز. قم بإجراء تعديلات أدق عن طريق تحديد علامة تبويب الأجهزة. قم بتغيير التركيز عن طريق ضبط شريط تمرير التركيز.
لضمان عدم وجود تشبع زائد ، حدد مستوى الكاميرا الأمثل عن طريق ضبط شريط التمرير داخل علامة تبويب الالتقاط. إذا كانت الأداة مزودة بهذا الملحق ، فقم بتحميل المحقنة التي تحتوي على عينة الناقل في مضخة المحقنة. ضمن علامة التبويب SOP ، حدد القياس القياسي لالتقاط خمس لقطات مدة كل منها 30 ثانية.
أدخل اسم الملف الأساسي ، وإذا رغبت في ذلك ، أضف معلومات عينة إضافية بالنقر فوق الزر "خيارات متقدمة" الذي سيفتح حوارا مشروطا بخيارات مختلفة. اضغط على إنشاء البرنامج النصي وتشغيله وانتظر ظهور نافذة منبثقة تطلب منك تقديم عينة متقدمة. إذا كنت تستخدم مضخة المحقنة ، فحدد علامة تبويب الأجهزة ثم علامة تبويب مضخة المحقنة.
اضبط معدل التسريب المطلوب واضغط على لبث. إذا لم تستخدم مضخة المحقنة ، فقم بتقدم العينة يدويا. في النافذة المنبثقة، حدد موافق لبدء الالتقاط.
بعد كل من اللقطات الخمس ، عندما تظهر العينة المنبثقة من فضلك المتقدمة ، تحقق من أن العينة لا تزال تتحرك عبر خلية التدفق. ثم حدد موافق لمتابعة الالتقاط التالي. في علامة تبويب العملية، اضبط شريط تمرير عتبة الكشف بين أربعة وثمانية لتحديد شركات النقل المميزة المرئية على الشاشة بشكل صحيح.
يمكنك ضبط كسب الشاشة للمساعدة في التصور ، ولن يؤثر ذلك على تحليل المصب. في النافذة المنبثقة، اضغط على موافق لبدء تحليل التتبع. راقب تقدم التحليل بالنقر فوق التحليل في علامة تبويب تحليل واحدة.
بمجرد الانتهاء من التحليل ، ابحث عن مطالبة إعدادات التصدير بالظهور. تأكد من تحديد تضمين PDF وتضمين ملخص التجربة. حدد أي تنسيقات تصدير أخرى حسب الرغبة.
في قسم النتائج في تصدير بيانات PDF ، للتأكد من أن التركيز المقاس موثوق به ، تحقق من أن تركيز الموجة الحاملة المقاس يتراوح بين 1x10 إلى السابع و 1x10 إلى الناقلات التاسعة لكل ملليلتر وتحقق من وجود أي رسائل خطأ أو رسائل تحذير أسفل نتيجة قياس التركيز. كرر الإجراء مرتين أو أكثر مع تخفيفات مختلفة من المخزون ، وتأكد من أن تركيز كل عينة يقع ضمن النطاق الخطي للأداة. احسب تركيز ناقل المخزون كما هو موضح في مخطوطة النص.
قم بإعداد محلول الفلوروكروم المترافق الحر أو الجسم المضاد كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب تركيز محلول المخزون من التركيز، والوزن الجزيئي، ورقم أفوجادرو كما هو موضح في المعادلة. ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي للصبغة في مخفف الناقل لتوليد عينات منحنى قياسية.
ثم أضف عينة الناقل إلى لوحة القياس وقم بقياس التألق باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. قم بإنشاء المنحنى القياسي كما هو موضح في مخطوطة النص. احسب شدة التألق المطلقة لكل ناقل بقسمة التألق السائب على تركيز الناقل.
قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي لتجربة الخلية الحاملة النهائية من خلال تحديد إعدادات الجهد الأمثل PMT في القنوات ذات الصلة. قم بتشغيل عينة تحكم سلبية حيث لا يتم تحضين الخلايا بناقلات لتحديد مضان الخلفية. إعداد وإعادة تعليق حبات قياس التدفق الخلوي.
استخدم نفس المخزن المؤقت المستخدم لعينات الخلايا. إذا تم توفير مجموعات الخرزة بشكل منفصل ، فقم بسحبها معا. قم بتشغيل حبة قياس التدفق الخلوي وعينات الخلية الحاملة لتحديد شدة التألق لكل خلية.
قم بتشغيل حبات مقياس التدفق الخلوي لتوليد منحنى قياسي ، وتحويل كثافة الفلورسنت المطلقة إلى MFI. استخدم هذا لحساب MFI النظري للناقلات كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بتشغيل عينات حامل الخلية لتحديد كثافة الفلورسنت لكل خلية من كل عينة.
أخيرا ، احسب عدد الناقلات لكل خلية لكل عينة عن طريق طرح مضان الخلفية من التألق المقاس للعينة ، ثم القسمة على التألق لكل جسيم. بالنسبة لجزيئات الغلاف الأساسية لحمض البولي ميثاكريليك 633 نانومتر ، كان التركيز وكثافة الفلورسنت لكل حامل قابلين للقياس الكمي مباشرة باستخدام تيار مقياس الخلايا. في المقابل ، كانت جسيمات أكسيد الحديد النانوية المغناطيسية الفائقة 100 نانومتر صغيرة جدا بحيث لا يمكن اكتشافها بشكل فردي وتم تحليلها باستخدام التيار السائب.
تم استخدام حبات القياس الكمي الموسومة في عدة أيام لتوليد منحنيات قياسية على مقياس التدفق الخلوي. كان الارتباط بين MFI المقاس وقيمة MESF لخرزات القياس الكمي خطيا ومتشابها إلى حد كبير بين التواريخ المقاسة. أظهرت تجارب الدورة الزمنية باستخدام خلايا HeLa الفلورية التي تحتوي على كبسولات حمض بولي ميثاكريليك 235 نانومتر من صفر إلى 24 ساعة زيادة في MFI بمرور الوقت ، مما يشير إلى ارتباط الكبسولات بخلايا HeLa.
كان الاختلاف في الاستجابة الخلوية الظاهرة للناقلات صارخا ، اعتمادا على القياس الكمي النسبي أو المطلق. كان القياس الكمي المطلق مستقلا عن كثافة وضع العلامات وبالتالي أكثر قابلية للمقارنة. هذه التقنيات هي الأساس لتحليل ومقارنة أعمق لأداء الجسيمات.
نحن متحمسون لاستخدام هذه التقنيات لتحديد معلمات النماذج الرياضية التي ستسمح لنا بتوصيف أداء الجسيمات بشكل مستقل عن أي تجربة معينة.
