تظل الاضطرابات المرتبطة ب RPE جزءا رئيسيا من مزج الأمراض ، ولكن بدون بقايا فعالة في الثقافة الافتراضية لخلايا RPE الأولية لتكون بمثابة نموذج جيد للدراسات الفسيولوجية والمرضية للاضطرابات المرتبطة ب RPE. في هذا البروتوكول ، نقدم بروتوكولا سهل المتابعة لزرع IPCs الأولية ، والذي يمكنه استعادة خصائص RP اللاحقة والحفاظ عليها بسرعة ، ونحن نعتقد أنه باستخدام هذه الطريقة يمكن للناس توليد خلايا RP بسرعة من دراسات macistate وفحوصات الأدوية الوقائية التي يمكن أن تسهل تطوير علاج جديد لاضطرابات RPE. سيجعل عرض القيمة خطوة بخطوة هذه الطريقة أسهل بكثير للتكرار في المختبرات المختلفة التي ترغب في دراسة خلايا RP.
لبدء ذوبان الجليد إنزيم هضم الأنسجة malaquad وتعقيم 1X PBS. مكمل ب 2٪ بنسلين و 2٪ ستربتومايسين عن طريق تصفية المحلول من خلال وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر. اغسل آبار لوحة الثقافة وإدراج transwell مع 1X PBS.
قم بإزالة PBS من الآبار و transwells باستخدام ماصة وإضافة ملليلتر واحد من 1X PBS الطازج إلى الغرفة السفلية و 600 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول Laminin إلى الغرفة العلوية. احتضان الألواح وإدراج transwell في حاضنة زراعة الحلزون هذه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول الرقائقي من الغرفة العلوية واغسله بملليلتر واحد من 1X PBS البارد مرتين قبل الجلوس في الخلية نظف غطاء التدفق الرقائقي بنسبة 75٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية.
قم بإعداد ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من الإيثانول بنسبة 75٪ ، وثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر تحتوي على حوالي 25 ملليلتر من 1X PBS ، وثلاثة أطباق لثقافة الخلايا المعقمة 10 سم تحتوي على حوالي 15 ملليلتر من 1X PBS. انقع أربعة مقل عيون خنزيرية في حوالي 15 ملليلتر من 75٪ إيثانول في طبق بتري 10 سم واستخدم مقصا وملقطا لقطع جميع الأنسجة الضامة والعضلات المتبقية. لتطهير مقل العيون ، نقع وغسل أربعة مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة بنسبة 75٪ من الإيثانول بالتتابع.
ثم اغسل مقل العيون في ثلاثة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 ملليلتر مملوءة ب 1X PBS بالتتابع. اقلب الأنابيب كل دقيقة لغسل مقل العيون جيدا. انقل مقل العيون الأربعة إلى طبق زراعة خلايا معقمة 10 سم يحتوي على 1X PBS.
تقليم السطح الخارجي لكل مقلة العين مرة أخرى ، لإزالة العصب البصري والحطام الصغير. استخدم المقص لعمل قطع صغير عند تقاطع النسيان والصلبة. ثم قم بإزالة القرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي والشبكية العصبية.
انقل مركب الصلبة المشيمية RPE إلى طبق جديد لزراعة الخلايا يبلغ طوله 10 سم وقم بعمل أربع قطع لتسطيح كوب العين على شكل برسيم من أربع أوراق. قم بإجراء رحلات في هضم محلول EDTA عن طريق وضع مجمعات الصلبة المشيمية الأربعة RPE في طبق جديد يبلغ طوله 10 سم وسكب 20 ملليلترا من محلول EDTA التربسين الطازج لدمج مجمعات الصلبة المشيمية RPE. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا.
بعد 30 دقيقة ، أخرج الطبق من الحاضنة ، وأضف 20 ملليلترا من وسائط زراعة الخلايا قبل التسخين مع 10٪ FBS إلى الطبق. لتحييد الرحلات في محلول EDTA ، استخدم ماصة نقل سعة خمسة ملليلتر لفصل خلايا RPE عن طريق السحب برفق عدة مرات. اجمع معلقات الخلية في أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، ثم الصق برفق 10 ملليلتر أخرى من وسائط الاستزراع الطازجة باستخدام FBS لغسل مجمعات RPE Choroids الصلبة على الطبق.
اجمع خلايا RPE عن طريق الطرد المركزي للأنابيب عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشاق SuperAgent باستخدام ماصة وإضافة خمسة ملليلتر أخرى من وسائط المزرعة مع FBS لإعادة تعليق الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 غرام لمدة خمس دقائق أخرى.
صب SuperAgent وأعد تعليق الخلايا ب 12 ملليلتر من وسائط الثقافة. البذور التالية 100،000 إلى 200،000 خلية لكل بئر في 12 لوحة استزراع البئر أو إدراج transwell. قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين وتقليل تركيز المصل إلى 1٪ عندما تغطي الخلايا سطح الآبار بالكامل لكل إدخال.
قم بتغيير وسائط الاستزراع كل يومين حتى يتم حصاد الخلايا. الصور التمثيلية لخلايا RPE الخنازير الأولية في اليوم الثاني واليوم السادس واليوم 10 موضحة هنا. تم الكشف عن تحليل QRTPCR لمستويات mRNA للجينات المميزة في خلايا RPE الخنازير الأولية ، وخلايا RPE البشرية الأولية ، وخلايا ARPE 19 والأنسجة المشيمية RPE الخنازير من خلال هذه الصورة الرسومية.
هنا تم استخدام GAP DH كجين التدبير المنزلي ل RTPCR. تم استخدام أربعة مكررات بيولوجية لخلايا RPE الخنازير الأولية وخلايا RPE 19 حيث تم استخدام ثلاث نسخ بيولوجية لخلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة المشيمية RPE الخنازير. تم تعيين مستويات التعبير الجيني في خلايا ARPE 19 كعناصر تحكم.
يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لبروتينات RPE 65 في ARPE 19 وخلايا RPE الخنازير وفي خلايا RPE البشرية الأولية وأنسجة RPE المشيمية الخنازيرية. تم استخدام Vinculin هنا كعنصر تحكم في التحميل. يوضح هذا الشكل ثقافة لمدة أسبوعين لخلايا RPE الخنازير في وسائط DMEM الأساسية مع 1٪ FBS.
كانت الخلايا المستزرعة مع أو بدون Lamin ملطخة ب RPE 65 و APTAs البوتاسيوم الصوديوم و Z01 و Hex. يتم تصوير قياسات TR في صفائح الخلايا ، المزروعة مع أو بدون laminin في هذا الشكل. يظهر في هذا الشكل تحليل الدم الغربي لعامل نمو بطانة الأوعية الدموية أو VEGF وعامل مشتق من ظهارة الصباغ أو PEDF في خلايا RPE و ARPE 19 الأولية للخنازير.
يتم عرض الوظائف القطاعية لخلايا RPE و ARPE 19 المزروعة في هذه الصور. الجزء الأكبر من هذا البروتوكول هو إذابة خلايا RP من مجمعات جليد RPE. نوصي باستخدام رحلات ومحلول جديد في كل مرة والتحكم بشكل صحيح في وقت الهضم ، لإذابة ثماني خلايا RP.
