يسمح هذا البروتوكول لعزل فعالة وثقافة خلايا RPE الماوس. ثقافات RPE الماوس الأولية صحية هي نماذج قيمة لفهم آليات أمراض العين الكامنة. الثقافات RPE التقاء وقابلة للحياة الحصول على في غضون ثلاثة أيام، ويمكن زراعتها لأسابيع.
وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لفهم الآليات الكامنة وراء الضمور البقعي المرتبط بالعمر المبكر، وهو السبب الرئيسي للعمى بين كبار السن في البلدان المتقدمة النمو. من المهم تصور خطوات التشريح. التفاصيل حاسمة لنجاح البروتوكول ، على سبيل المثال ، كيفية التعامل مع مقل العيون بحيث لا يتم لكم الصلبة ، حيث يجب إجراء تخفيضات بالضبط ، وكيفية تضمين أكواب العين في التريبسين بحيث تبقى مفتوحة.
ابدأ بإعداد جميع الكواشف اللازمة للبروتوكول. ثم، ابدأ في تنظيف مقلة العين عن طريق إزالة جميع الأنسجة الضامة والدم والعضلات بعناية، وذلك باستخدام ملقط Dumont رقم خمسة ومقص الزاوية، دون إجراء أي تخفيضات في الصلبة. نقل مقلة العين إلى طبق جديد يحتوي على ثلاثة ملليلترات من العازلة HBSS خالية من HEPES بانتظام للحفاظ على العين جديدة ونظيفة وتجنب أي تلوث.
استخدم العصب البصري كمقبض لعقد مقلة العين وجعل ثقب في وسط القرنية مع الصلب الكربوني الحاد رقم 11 شفرة. إجراء ثلاثة شقوق في القرنية من خلال ثقب مع مقص رقم خمسة دومون، وضمان أن هناك مساحة كافية لإزالة العدسة. عقد العصب البصري وتطبيق ضغط طفيف على سيراتا أورا مع قاعدة مقص الزاوية، حتى العدسة يخرج تماما.
الحفاظ على ظهارة القزحية سليمة لمنع انفصال الشبكية العصبية وRPE أثناء الحضانة. ضع العين في العازلة HBSS خالية من HEPES. احتضان العينين دون عدسات في محلول الهيالورونيوم في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون Aerated لفصل شبكية العين العصبية من RPE.
ضع كل عين في بئر جديد مع 1.5 ملليلتر من العازلة HBSS HEPES الباردة لكل بئر واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد الغسيل، ضع كل عين في طبق ثقافة 35 ملليمتر مع مخزن HBSS HEPES المؤقت الطازج. قطع القرنية من خلال الشقوق الأصلية مع مقص فاناس ثمانية سنتيمتر حتى يتم التوصل إلى أورا سيراتا، ثم قطع تحت سيراتا أورا لإزالة ظهارة القزحية والقرنية.
عقد سيراتا أورا مع ملاقط منحنية واستخدام ملقط صغير الزاوية، وسحب بعيدا شبكية العين العصبية، والتأكد من أن لا يتم قطع طبقة RPE. ثم، قطع التعلق الداخلي إلى العصب البصري. قطع العصب البصري ونقل كل كوب العين إلى لوحة بئر مختلفة 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من التريبسين-EDTA الطازجة لكل بئر.
تأكد من أن أكواب العين لا تزال مفتوحة ومغمورة بالكامل في التريبسين. احتضان أكواب العين في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. جمع كل كوب العين جنبا إلى جنب مع أي ورقة RPE فصل خلال حضانة التربسين ونقلها إلى لوحة بئر 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول FBS لكل بئر.
إذا كانت أوراق RPE تبقى في الحل تريبسين، استخدم micropipette لنقلها إلى البئر مع حل FBS. عقد كل كوب العين من العصب البصري ويهز وجهه إلى أسفل في لوحة بئر 12 تحتوي على 1.5 ملليلتر من 20٪ FBS في HBSS HEPES العازلة حتى يتم تحقيق مفرزة كاملة من أوراق RPE. جمع أي أوراق RPE ومجموعات RPE مع micropipette، وتجنب أي قطع بيضاء من الصلبة أو المشيمية، والتي يمكن أن تلوث الثقافات، ووضعها في أنبوب 15 ملليلتر.
سحب عينين من نفس الماوس في أنبوب واحد. ثم، طرد مركزي خليط RPE في 340 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. إعادة إنفاق بلطف بيليه RPE في خليط ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضانه لمدة دقيقة واحدة في حمام مائي في 37 درجة مئوية لتصنيف أوراق RPE إلى خلايا واحدة.
ثم ماصة بلطف صعودا وهبوطا 10 مرات، وتجنب تشكيل فقاعة. إضافة تسعة ملليلتر من المتوسط RPE أعدت حديثا لتخفيف وتعطيل التريبسين والطرد المركزي الخليط في 340 × ز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant وإعادة إنفاق بعناية بيليه الخلية في 150 ميكرولتر من المتوسط RPE مع 5٪ FBS.
بعد ذلك ، قم بإزالة PBS من الغرفة السفلية لإدراج الغشاء المغلف بالطبقة المعد مسبقا وإضافة 700 ميكرولتر من RPE المتوسطة إليه. إزالة صفح من الغرفة العليا من إدراج الغشاء وتوزيع تعليق الخلية RPE قطرة الحكمة وموحدة إلى وسط الغرفة. ضع الغشاء دون إزعاج في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
ثم تحقق من إدراج الغشاء تحت المجهر للتأكد من أن معظم خلايا RPE متصلة بإدراج والالتقاء هو على الأقل 50٪ لا تغيير وسائل الإعلام خلال الساعات ال 72 الأولى. أظهرت خلايا RPE المعزولة باستخدام هذا البروتوكول حجم RPE النموذجي ، ومورفولوجيا ، وتصبغ. ولوحظ بعد أسبوع واحد وجود طبقة أحادية من نوع RPE شديدة الاستقطاب مع نواتين انضمت إليهما تقاطعات ضيقة، إلى جانب وجود شقوق صغيرة ومجلدات القاعدية.
وقد تأكدت الاستقطابات في الطبقة الأحادية من RPE من خلال قيم TER، حيث كان المتوسط أعلى من 200 أوم سنتيمتر مربع، والتي ظلت مستقرة مع مرور الوقت. في مقايسات البلعوم التي أجريت على FITC المسمى نقاط البيع البقرية ، لوحظ ابتلاع وهضم نقاط البيع ، مما يشير إلى تشكيل طبقة أحادية التقاء وظيفية من خلايا RPE. تتطلب الثقافات القابلة للحياة وقتا قصيرا للتشريح ، وهو ما يتحقق بالخبرة.
قد تبقى بعض خلايا RPE متصلة شبكية العين العصبية، ولكن إذا ظلت عدة أوراق RPE متصلة، فلن ينجح البروتوكول. يجب استخدام الهيالورونيديز الطازج في كل مرة لمنع هذه المشكلة. هذه الثقافات خلية RPE الماوس الأولي وظيفية هي أداة قيمة لدراسة علم الأحياء المرضية من RPE في العديد من أمراض العيون.
على سبيل المثال، جعل هذا البروتوكول من الممكن دراسة علم الأحياء المرضية للRPE في نموذج الماوس من الضمور البقعي.
