يقلل البروتوكول بشكل كبير من عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا في البويضة. وقد يكون ذلك مفيدا للاستنساخ داخل الأنواع. تقلل هذه الطريقة من أعداد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا في البويضات البقرية بأكثر من 90٪ مما قد يقلل من حدوث الهيلوبلازما الميتوكوندريا في الأجنة المستنسخة.
ستقوم لورا آدامز ، طالبة الدكتوراه من مختبري ، بعرض الإجراء. للبدء ، باستخدام ماصة ، قم بجمع البويضات الناضجة المختارة من قطرة HSOF ، وضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول HSOF CB. الطرد المركزي للبويضات في 15،000 مرات G لمدة 12 دقيقة.
أثناء طرد البويضات مركزيا ، قم بإعداد لوحة المقطع الثنائي. لهذا ، ابدأ بعمل نمط على غطاء طبق بتري 60 ملم باستخدام 20 ميكرولتر لكل قطرة ، وقم بتغطية القطرات بالكامل بالزيوت المعدنية. باستخدام علامة رفيعة مائلة ، ضع علامة على الخطوط الموجودة أسفل الطبق.
قم بتغطية الطبق بغطاء غير شفاف حتى يكتمل الطرد المركزي لمنع تغيرات الأسمولية للقطرات الدقيقة. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، استخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع البويضات داخل المحلول ، ونقلها إلى جزء فارغ من لوحة بحث جديدة مع أربع قطرات HSOF سعة 400 ميكرولتر ، قبل غسل البويضات من خلال قطرات HSOF. قم بتشغيل مرحلة التسخين إلى 38.5 درجة مئوية.
استخدم ماصة الفم لنقل البويضات التي يتم طردها مركزيا من قطرة HSOF إلى أعلى يسار قطرة T2 من لوحة المقطع الثنائي. ثم اغسل البويضات من خلال القطرات الثلاث التالية في الصف العلوي. قم بإيداع البويضات في واحدة من قطرات pronase ، مما يضمن وجود اتصال ضئيل أو معدوم بينهما.
راقب البويضات حتى يكون هناك تشوه واضح في zonae pellucidae. بمجرد أن تصبح منطقة البويضة الواحدة مشوهة ، انقل تلك البويضة إلى قطرة T2 المجاورة. كرر ذلك عندما تصبح البويضات الإضافية مشوهة ، حتى تتم إزالة جميع البويضات من البروناس ووضعها في قطرة T2.
راقب البويضات حتى تبقى طبقة رقيقة فقط من المنطقة البيلوسيدا. اغسل البويضات من خلال القطرات الثلاث التالية داخل الصف ، ثم قم بإيداعها في خطوط رأسية داخل قطرات CBT20. ابدأ بعدد أقل من البويضات في الخطوط الرأسية ، وقم بزيادة عدد البويضات لكل قطرة مع تقدم مهارات القطع.
ركز على أول قطرة CBT20 في أقصى اليسار تحتوي على البويضات ، واستخدم ماصة الفم لتدوير البويضات بحيث يكون الجزء الكثيف من الميتوكوندريا من كل بويضة إما متجها نحو ذراع المجهر أو بعيدا عنه. ضع طرف الشفرة الدقيقة على يسار البويضة العلوية ، بما يتماشى مع المساحة الموجودة فوق الجزء الكثيف من الميتوكوندريا مباشرة. الحفاظ على طرف الشفرة في نفس المكان ، قم بخفض الشفرة بعناية لقطع كل الطريق من خلال البويضة.
تأكد من أن البلاست الكثيف بالميتوكوندريا والبلاستلة المختزلة بالميتوكوندريا من نفس الحجم تقريبا ، وأن الشفرة تقسم في أوضح جزء من بويضة الطرد المركزي. عند رفع الشفرة ، تأكد من الحفاظ على نفس الخط ، وأن طرف الشفرة يبقى في نفس المكان ، ثم ارفع الطرف برفق من اللوحة. كرر خطوات الاستئصال الثنائي لجميع البويضات خلال قطرة المقطع الثنائي الأولى.
إذا كانت البويضات موجودة في قطرات إضافية ، فقم بتوجيه البويضات المتبقية وتقسيمها. باستخدام ماصة الفم ، اجمع البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا من أول قطرة مقطعة. ضعها في قطرة T20 اليسرى الموجودة في الصف السفلي من اللوحة.
كرر ذلك لجميع قطرات المقطع الثنائي المتبقية. باستخدام ماصة الفم ، اجمع البلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا من أول قطرة ثنائية القطع. ضعها في قطرة T20 اليمنى الموجودة في الصف السفلي من اللوحة.
كرر ذلك لجميع قطرات المقطع الثنائي المتبقية. استرجع طبق T10 المكون من أربعة آبار من الحاضنة. باستخدام ماصة فم، انقل جميع البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا إلى MR المسمى جيدا، وانقل البلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا إلى M.ضع الصفيحة ذات الأربعة آبار مرة أخرى في الحاضنة التي يتم التحكم فيها بثاني أكسيد الكربون.
اسمح للأوبلاستيدات بالراحة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تحديد كمية mtDNA. من أجل عملية استئصال ناجحة ، فإن العينات من البويضات الكاملة والبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا لها قيم مقطعية مماثلة. العينات من البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا لها قيم تصوير مقطعي أعلى عند مقارنتها بالعينات من المجموعتين الأخريين.
بالنسبة للتقسيم الثنائي غير الناجح ، لا يقلل المقطع الثنائي من محتوى mtDNA بشكل فعال في البلاستيدات التي يتم تخفيضها بواسطة الميتوكوندريا. بعد إنتاج منحنى قياسي واستخدام صيغ رقم نسخ mtDNA المقدمة ، تم تحقيق متوسط تخفيض mtDNA للبويضة بنسبة 93.88٪ باستخدام هذا البروتوكول. إن توجيه كل بويضة بشكل صحيح في قطرة المقطع الثنائي ، وتقسيم كل بويضة بدقة ، وفرز البلاستيدات بدقة ، كلها خطوات حاسمة يجب اتخاذها من أجل الحصول على نتائج ناجحة.
يمكن دمج اثنين من ooplasts مع خلية جسدية واحدة. ويمكن بعد ذلك تنشيط التوائم الثلاثة المنصهرة كيميائيا واستزراعها كأجنة أعيد بناؤها.
