يتيح PCR القطيرات الرقمية دقة وحساسية معززتين مقارنة ب PCR الكمي. هذه طريقة بسيطة ل PCR القطيرات الرقمية التي تتطلب الحد الأدنى من المعدات وعدم وجود خبرة. مستحلب الجسيمات قالب هو طريقة خالية من microfluidic مستحلب التي لا تتطلب أي معدات متخصصة.
بالإضافة إلى ذلك، يحدث مستحلب على مدى فترة من الثواني والمقاييس لحجم الحاوية. بالنسبة للخرزات التجارية، أضف 0.5 جرام من جزيئات البولي أكريلاميد المجففة المتوافقة مع استحلاب قالب الجسيمات، أو PTE، إلى 30 ملليلتر من الماء العقيم في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، واخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
لتصنيع microfluidic من الخرز، صب ملليلتر واحد من فوتوريست على وسط رقاقة السيليكون ثلاثة بوصة، ومن ثم تدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية، تليها 1250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتتبخر المذيبات. قم بتأمين قناع الصورة على رقاقة السيليكون مع شريحة زجاجية تغطية، وفضح الرقاقة تحت LED للأشعة فوق البنفسجية المحصلة لمدة 2.5 دقيقة.
ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للخبز بعد التعرض. تطوير رقاقة السيليكون الضوئية عن طريق غمرها في حمام من PGMEA 100٪ لمدة تصل إلى 15 دقيقة. شطف رقاقة مع الطازجة 100٪PGMEA، تليها 100٪ isopropanol.
يجفف الرقاقة الهواء، ثم يجففها على طبق ساخن إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ويوضع في طبق بيتري نظيف مقاس ثلاثة بوصات. مزيج قاعدة السيليكون PDMS وشفشف المعالجة في نسبة 10:1، ثم ديغا PDMS مختلطة باستخدام مجفف تحت فراغ حتى لا فقاعات الهواء يمكن ملاحظتها. صب PDMS degassed في طبق بيتري، وضمان أن رقاقة السيليكون مغمورة تماما.
ديغا رقاقة السيليكون وPDMS، ومن ثم علاج PDMS عن طريق وضع رقاقة السيليكون في فرن تعيين إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. استئصال كتلة من PDMS التي تحتوي على ميزات microfluidic من طبق بيتري، وذلك باستخدام مشرط. لكمة المداخل ومنافذ في كتلة PDMS باستخدام لكمة خزعة 0.75 ملليمتر.
ثم إزالة أي الغبار والجسيمات مع التطبيق المتكرر وإزالة الشريط التعبئة والتغليف إلى سطح الكتلة. تنظيف شريحة زجاجية عن طريق الشطف مع 100٪ isopropanol، وبعد ذلك الهواء تجفيف السطح. البلازما علاج كل من الشريحة الزجاجية وPDMS مع ملليبار واحد من البلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة، وذلك باستخدام المستعبدين البلازما.
ألصق PDMS على الشريحة الزجاجية عن طريق وضع PDMS المعالج بالبلازما مع ميزات تواجه أسفل على الشريحة الزجاجية ، والجانب المعالج بالبلازما التي تواجه لأعلى. ضع الشريحة في فرن تم ضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، لإكمال الترابط. علاج جميع القنوات microfluidic مع معالجة السطح المفلور لضمان رهاب الماء السطحي، ثم خبز الجهاز في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
تحميل كل من البولي أكريلاميد، أو PAA، وh hydrofluoroether، أو HFE، المحاقن التي تحتوي على حل في مضخات حقنة. قم بتوصيل كلا المحاقن بجهاز microfluidic باستخدام أنابيب البولي إيثيلين. تشغيل جهاز توليد قطرة وجمع ملليلتر واحد من قطرات في أنبوب جمع 15 ملليلتر، ثم احتضان لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة للبوليمرة.
بعد الحضانة، قم بإزالة الطبقة السفلى من الزيت عن طريق الأنابيب. أضف ملليلتر واحد من 20٪ PFO في زيت HFE إلى أنبوب التجميع 15 ملليلتر كمبيد للتمائم الكيميائي. بعد الخلط، قم بتدوير أنبوب التجميع 15 ملليلتر عند 2000 × ز، لمدة دقيقتين.
إزالة الطبقة السفلية عن طريق pipetting، وتكرار العملية مرة أخرى. أضف ملليلترين من أحاديات اليوربيتان بنسبة 2٪ في الهيكسان إلى أنبوب التجميع 15 ملليلتر ودوامة ذلك. تدور الأنبوب في 3000 × ز لمدة ثلاث دقائق، وإزالة supernatant عن طريق pipetting لإزالة محلول السطحي.
كرر هذا مرتين. إضافة خمسة ملليلتر من TEBST العازلة وتخلط جيدا، ثم تدور أسفل في 3000 × ز لمدة ثلاث دقائق وإزالة supernatant عن طريق pipetting. كرر هذا ثلاث مرات، ثم إعادة الإنفاق في خمسة ملليلتر من TEBST.
إعداد جزيئات البولي أكريلاميد لاستحلاب الجسيمات قالب عن طريق الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة دقيقة واحدة بيليه الجسيمات. ثم إزالة supernatant عن طريق الأنابيب، وإعادة إنفاق بيليه في الماء العقيم. كرر ثلاث مرات لضمان إزالة أي TEBST المتبقية.
إعداد مرحلة التفرق في أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر، وذلك باستخدام مزيج رئيسي PCR، والمبرمجين المناسبة، ومسبار التحلل المائي الفلورسين، كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تحت التحريض لطيف، وذلك باستخدام أنبوب الدوار. الطرد المركزي مرحلة تفريق في 6000 س غ لمدة دقيقة واحدة وإزالة supernatant.
إضافة ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجينوم Saccharomyces cerevisiae إلى بيليه، وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب أو التنصت قوية. إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ الفلوروسورفاكانت في زيت HFE إلى الأنبوب، لاستحلاب. قم بإزاحة بيليه عن طريق الأنابيب أو النقر على الأنبوب ، ثم دوامة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
السماح للاستحلابات لتسوية لمدة دقيقة واحدة، ثم إزالة 100 ميكرولتر من مرحلة النفط السفلي، واستبدال هذا الحجم مع 2٪ جديدة fluorosurfactant في زيت HFE. عكس بلطف أنبوب عدة مرات لخلط. كرر هذا ثلاث مرات أو أكثر، حتى تتم إزالة قطرات الأقمار الصناعية الصغيرة.
بعد دقيقتين إلى خمس دقائق من الاستقرار، قم بإزالة مرحلة الزيت السفلي. استبدل هذا الحجم ب 5٪ فلوروسورفاتانت في زيت الفلوروكربون. ماصة 100 ميكرولتر من العينة في أنابيب PCR 200 ميكرولتر، ووضع أنابيب PCR في دراجة حرارية.
ماصة العينة على شريحة العد للتصوير الفلورسنت، وصورة العينة. مستحلب الجسيمات قالب يتيح monodispersity رائعة. كما تتم إزالة supernatant الزائدة استقرار السطحي يضاف، ويتم دوامة العينة لتوليد مستحلب.
تتكون القطرات الناتجة من عينة نواة الجسيمات والحوافض التي تحتوي على الكواشف وجزيئات العينة أو الخلايا اللازمة للتفاعل. تشير القطرات المتعددة الأضلاع ذات الجسيمات المتمبلرة إلى دوامة غير كافية. وثمة مسألة أخرى هي توليد سواتل مفرطة، تقلل من كفاءة التغليف.
وينبغي ألا تشكل السواتل أكثر من 10 في المائة من مجموع حجم العينة المغلفة. ويمكن تطهيرها من مستحلب عن طريق غسل مع الزيت الطازج. ويمكن إثبات فائدة PTE في PCR الرقمية عندما تصبح قطرات تحتوي على أهداف مكبرة الفلورسنت، مما يسمح بالكمية المباشرة للأهداف.
قطرات الفلورسنت تسفر عن عدد قليل من الإيجابيات عندما يكون الهدف نادرا، وكثير عندما تكون وفيرة. هذه النتائج قابلة للتكرار باستخدام جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا، وتحقيق قياسات دقيقة على نفس النطاق. إزالة supernatant من مرحلة تفريق مهم لتغليف العينة.
معرفة حجم بيليه وsupernatant يمكن أن تساعد في تحديد واجهة بين البلدين. عندما تكون في شك، يخطئ على جانب إزالة supernatant.
