وقد أعاقت صعوبة تنقية البحوث في بيولوجيا قطرات الدهون. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب دراسة تدفق الدهون الخلوية تنقية متزامنة من العضيات المتعددة، ولم تكن هناك بروتوكولات بسيطة متاحة حاليًا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو جعل تنقية قطرات الدهون أكثر سهولة.
قمنا بتعديل مجموعة متاحة تجاريا لعزل قطرات الدهون في وقت واحد ، إندوبلاسميك التشنج ، وlysosomes من عينة واحدة. تراكم قطرات الدهون الكبد يهيئ السمنة والمرضى الكحولية لمرض الكبد التدريجي. وقد حوّل ذلك وجهة نظر قطرات الدهون من مقصورات التخزين الخاملة إلى العضيات الحيوية المهمة بيولوجياً.
للبدء ، استخدم ملقطًا معقمة ومقصًا لتشريح الجلد والعضلات من بطن الفأرة الرحيم على المحور الأمامي ، مما يعرض الكبد. قطع الأربطة التي تربط الكبد إلى الأمعاء. باستخدام ملقط، سحب الأمعاء بعيدا عن الكبد، نحو الخلفي.
قطع الرباط الذي يربط الكبد إلى الحجاب الحاجز. ثم، قطع بين الكبد والقفص الصدري الظهري، والانتقال من الأمامي إلى الخلفي، حتى يتم تحرير الكبد. نقل الكبد إلى طبق بيتري الباردة خمسة سنتيمترات مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة 1x، وغسل الكبد مرتين على منصة هزاز في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة 1X لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد الغسيل النهائي ، صب قبالة برنامج تلفزيوني 1x ، واستخدام شفرة جراحية معقمة الحجم 10 لنرد الكبد في ثلاثة إلى خمسة ملليمترات القطع داخل الطبق. ثم، غسل الكبد مكعبات مرتين مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد 1x لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. Decant برنامج تلفزيوني 1x، ونقل قطع الكبد مكعبات إلى 45 ملليلتر التجانس دونسي الباردة، وضمان جميع القطع هي في الجزء السفلي.
إضافة سبعة ملليلتر من الباردة 1x IE العازلة. التجانس على الجليد عن طريق تحريك الآفات صعودا وهبوطا 20 مرة، والتأكد من أن الآفة يذهب إلى الجزء السفلي من التجانس خلال كل السكتة الدماغية. نقل المتجانسة إلى أنبوب الطرد المركزي الباردة 15 ملليلتر.
شطف التجانس مع ملليلتر واحد من الباردة 1x IE العازلة، وإضافته إلى بقية التجانس. لإزالة النوى، الطرد المركزي المتجانس في جهاز طرد مركزي عالي السعة في 1،000 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تأكد من أن أي الدهون التي تم جمعها في الجزء العلوي من أنبوب 15 ملليلتر هو resuspended لمنع فقدان LD.
التأكد من أن بيليه النووية في الجزء السفلي من الأنبوب غير مضطربة، ونقل فائقة ما بعد النووية التي تحتوي على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي بارد طازج 50 ملليلتر. نقل aliquot 100 ميكرولتر من عظمى ما بعد النووية إلى أنبوب microcentuguge الباردة 1.7 ملليلتر على الجليد لتحليل النقاء في وقت لاحق. لإزالة الميتوكوندريا، الطرد المركزي العينة فائقة ما بعد النووية في جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة في 12،000 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
تأكد من أن أي الدهون التي تم جمعها في الجزء العلوي من الأنبوب هو resuspended لمنع فقدان LD، ومن ثم نقل سوبرنات ما بعد الميتوكوندر إلى أنبوب 13 ملليلتر فائقة التركيز. نقل 100 ميكرولتر aliquot من ما بعد الميتوكوندريا supernatant إلى أنبوب microcentuge 1.7 ملليلتر الباردة على الجليد لتحليل النقاء في وقت لاحق. ملء أنبوب فائقة التركيز مع ما بعد الميتوكوندريا supernatant إلى حافة مع الباردة 1x IE العازلة، لمنعها من الانهيار أثناء الطرد فوق المركزية.
توازن العينات، ومن ثم الطرد المركزي في الطرد فائقة المركزية في 100، 000 مرات ز لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية. لإزالة طبقة LD، إمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة، وpirate مع ماصة زجاجية. بعد نقل بيليه إلى أنبوب الطرد الدقيق 1.7 ملليلتر بارد ، جمع 100 ميكرولترات من ما بعد ER عظمى تحت طبقة الدهون لتحليل النقاء.
لبيدي أي حطام الخلية، الطرد المركزي في الطرد المجهري في السرعة القصوى لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم، تسخين الأنبوب بلطف مع اليدين للمساعدة في إعادة تعليق طبقة LD، ونقل المغرور، بما في ذلك طبقة الدهون، إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر microcentrifuge. كرر هذه الخطوات الغسيل، وتسخين الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات، حتى بيليه لم يعد مرئيا.
ثم، لغسل ناظر LD الخالي من الكريات، أضف 1x PBS إلى حجم نهائي من 1.5 ملليلتر، وطاردة مركزية في ميكروسنتريفوج بسرعة قصوى لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استخدام ماصة زجاجية لإزالة ملليلتر واحد من 1X PBS، الذي هو تحت طبقة الدهون، دون إزعاج طبقة الدهون. كرر غسل LD أربع إلى خمس مرات، حتى 1x PBS شفافة بصريا مع عدم وجود عكر.
ثم، استخدام ماصة زجاجية لإزالة كل 1X برنامج تلفزيوني تحت طبقة الدهون، واستخدام الناتجة كسور LD النقية لتحليل المصب. عندما تم أخذ ممثل 20x الفلورسنت و Brightfield LD الصور من كل من ER عدة LD العزل وأساليب العزل السكروز LD, أنها كشفت عن مستويات مماثلة من الجسيمات المواد, مما يشير إلى تنقية مماثلة باستخدام بروتوكولين مختلفين. بعد تنقية, تم قياس مستويات البروتين البروتين و LD الدهون باستخدام المقايسات colorimetric, وتم تطبيع البيانات إلى وزن الكبد, تبين أنه عندما تم تطبيع المواد الأولية, LD الدهون الثلاثية وغلة البروتين كانت مماثلة باستخدام طقم ER وطريقة السكروز.
تم تحديد أقطار LD باستخدام برنامج تحليل الصور ، مما يدل على أن مجموعة ER LD العزلة وعزلة sucrose LD أسفرت عن LDs من أحجام مماثلة. لتقييم نقاء LD ، تم فحص العينات عن طريق التنمون ، مما يدل على أن LDs المستمدة من طقم ER LD العزل وبروتوكول التدرج السكروز على حد سواء كان على قدم المساواة النقاء. تم الكشف عن PLIN2 ، وهي علامة LD ، في جميع العينات باستثناء مجموعة ER LD العزل PER و PNS من السكروز.
تحليل النقاء من ER كسر باستخدام مناعة يظهر أنها كانت خالية من LD علامة PLIN2 ولكن كان مستويات كبيرة من البروتين ER SEC61A. كما تم تقييم نقاء الكسر الليسوميوم بعد المزيد من تنقية الليسوزومات باستخدام مجموعة التخصيب الليسوسوم. الاكتشاف هو حاليا التطبيق الأكثر فائدة لبروتوكولنا.
نحن أداء الدهون في العضيات النقية، وأظهرت زيادة السموم الدهنية على وجه التحديد في قطرات الدهون في أمراض الكبد الكحولية.
